不同干預方式對ASD大鼠認知能力的影響及機制探討*

魏渼淇 劉忠民 馮廣智

(1.廣西幼兒師范高等?？茖W校，南寧 530000)(2.海南科技職業大學，?？?570000)

孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD)，也稱孤獨性障礙(autistic disorder)，是包括了典型孤獨癥、自閉癥及其他社交功能障礙疾病的一種先天疾患。近幾十年來，我國自閉癥患兒數量日益增多，自閉癥致殘率的居高不下[1]，給患兒家庭和社會造成了巨大的經濟負擔，改善自閉癥的核心癥狀的研究顯得十分迫切，因此許多研究者在積極尋找ASD的病因與治療方法。體育運動干預作為一種便捷、有效的自閉癥康復手段，近年來受到越來越多的重視。崔碧玉[2]研究證實運動健身活動干預對孤獨癥兒童具有正面的促進作用；張嵐[3]研究證實體育運動和游戲相結合的康復訓練能夠提高ASD患兒的社交能力、耐力和運動能力。豐富環境[4]已證實可通過增強腦結構及功能可塑性進而改善個體的學習記憶和認知行為。周潔[5]研究顯示豐富環境可逆轉丙戌酸鈉(VPA)誘導的ASD大鼠學習記憶功能異常。有氧運動可改善自閉癥模型大鼠的學習記憶能力，顯著提高PSD-95(postsynaptic density protein 95，PSD95)在大鼠海馬的表達水平，但其機制并不明確。PSD-95作為一種功能橋蛋白可將NRXN-NLGN-SHANK通路串連，此信號通路調控突觸形成、傳遞、可塑性和成熟，其異?？赡軐е翧SD發病[6]。本研究觀察有氧運動、豐富環境及二者結合對ASD模型鼠認知能力的影響，并進一步選擇與NRXN-NLGN-SHANK信號通路緊密相關的ASD易感基因NRXN1、NL3以及Shank3在大鼠海馬組織的表達情況作為觀察目標，以期為有氧運動、豐富環境及兩者結合治療自閉癥提供新的理論基礎和實驗依據，并為基因通路治療自閉癥提供新的治療策略。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康成年SPF級Wistar大鼠40只，雌雄各半，雌性大鼠體質量175～225 g，雄性大鼠體質量300～350 g，購自吉林大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(吉)2016-0001，生產子代仔鼠(不限雌雄)共110只，實驗用50只。動物實驗場所：吉林大學基礎醫學院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK(吉)2018-0001。福利倫理審查編號：20190509。

1.2 主要試劑和儀器

VPA(碧云天生物科技有限公司)；二甲基亞砜(Biological Industries)；臺盼藍細胞染料(北京鼎國生物有限公司)；細胞裂解液(BD)；胎牛血清(Corning)；兔抗小鼠NRXN1和兔抗小鼠NL3(Thermo Fisher Scientific)；Shank3多克隆抗體(艾美捷科技有限公司)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及實時定量PCR試劑盒(北京全式金生物科技有限責任公司)；磷酸鹽緩沖液和RNase-Free water(Sigma)。紅外曠場實驗系統與Smart3.0全新行為學視頻分析系統(東樂自然基因生命科學公司)Morris水迷宮(安徽淮化正華生物儀器設備有限公司)；高速大容量離心機(BECKMAN)；EthoVisionXT運動軌跡跟蹤系統(贊德儀器有限公司)；實時熒光定量PCR儀(ABI)。

1.3 動物模型的建立及分組

選取健康成年Wistar大鼠40只，雌雄各半，于SPF環境中飼養一周。適應環境后，1∶1合籠過夜，次日將檢查到陰栓的雌鼠換籠，進行隔離飼養。以見陰栓當日為懷孕第一天，記E1(embryonic day)。將16只受孕雌鼠隨機分為兩組，一組為模型組，另一組為對照組。模型組參照Schneider等[7]的建模方法，E12.5時對該組孕鼠按600 mg/kg腹腔注射250 mg/mL VPA，模型組子代仔鼠合計52只，其中經行為學檢測成功可作為ASD模型鼠的48只，成模率92.3%。挑選40只運動ASD模型鼠，分為有氧運動組、豐富環境組、有氧+環境組以及ASD模型組，每組10只。對照組的孕鼠常規飼養，子代仔鼠合計58只，在其子代隨機挑選10只作為空白對照組。

1.4 干預前行為學檢測

仔鼠出生一周后，進行ASD樣行為學檢測，與空白對照組相比，篩選出具有明顯自閉癥樣行為的小鼠為ASD模型鼠。仔鼠出生當日為產后第1天，記PN1(postnatal day，PN)。

1.4.1方向趨向檢測：于PN7～PN10對仔鼠進行檢測，將仔鼠頭朝向下方置于傾斜角度25°的光滑斜板上，記錄其轉身角度180所需時間。

1.4.2游泳行為實驗：于PN8、PN10、PN12和PN15將各組仔鼠依次單獨放入28 ℃的恒溫水槽，觀察5～10 s，對其游泳能力進行評分并記錄。評分標準：耳朵超過水位線，4分；水位線在耳朵中間，3分；鼻子超過或與水位線平齊，2分；鼻子在水位線下，1分。

1.5 干預方法

有氧運動組：于PN31開始接受有氧運動干預，持續8周，6次/周；每次在同一時間段，持續90 min的游泳運動；豐富環境組：于PN31飼養于內有各種玩具，可供大鼠嬉戲、玩耍及社交的豐富環境飼養籠中；有氧+環境組：于PN31接受運動干預，同時在豐富環境中飼養；空白對照組和ASD模型組：常規飼養，不予干預。

1.6 干預后行為學檢測

干預后，采用曠場實驗和Morris水迷宮實驗觀察其行為學表現。

1.6.1曠場實驗：在40 cm的測試盒中進行，觀察其行為學表現，曠場分為4場，共16個方格，中間的4個為中央區域，其余12個為周圍區域。將大鼠分組放置中間區域開始實驗，使用紅外曠場實驗系統監測5 min，使用Smart 3.0行為學視頻分析系統統計穿格次數。

1.6.2Morris水迷宮實驗：實驗裝置為一個圓柱形水桶，直徑140 cm×50 cm及一個站臺，直徑為7 cm。以桶兩條互相垂直的直徑將水池分為4個象限，以不同顏色的阿拉伯數字標記4個象限，將數字貼于水桶周圍。將水溫保持20～22 ℃，水深調節至40 cm，將站臺放置在第二象限中心且低于水面1 ～2 cm處。實驗前5 d為定向航行階段，此階段每天進行4次訓練，每次每只大鼠從不同象限進入水池。訓練內容是將做好標記的大鼠從4個象限邊緣中心點、面向水池壁輕放入水池，讓其自主尋找平臺，60 s內找到平臺的大鼠逃避潛伏期記為找到平臺所用時間；60 s內未找到平臺的大鼠，用一根小木棍引導該大鼠至平臺上停留，停留10 s，記該鼠潛伏期為60 s。訓練結束后撤去平臺，進行實驗，將大鼠面向水池壁放入水池，進行巡航，采用EthoVisionXT運動軌跡跟蹤系統記錄大鼠60 s探索水池軌跡，分析大鼠在原平臺所在象限時間。

1.7 樣本采集和處理

斷頸處死大鼠，從枕骨大孔處打開顱腔，完整取出大腦，根據大鼠腦立體定位冰上剝離兩側海馬，置于凍存管中，經液氮速凍后取出，保存于-80 ℃冰箱。

1.8 Western blot檢測大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白表達水平

1.8.1總蛋白的提取：稱取凍存的海馬組織置入勻漿器，PBS沖洗后加入蛋白質裂解液，冰浴同時研磨勻漿，裂解0.5 h后，12 000 r/min、4 ℃離心5 min。移液管吸取上清層至新EP管，-20 ℃保存。

1.8.2檢測樣品蛋白含量：BCA法測定。

1.8.3電泳：配制電泳所需的分離膠與濃縮膠，加入TEMED后灌膠，完成后用水沖洗，放入電泳槽。加樣，每條泳道蛋白樣品上樣量為20 μg，緩慢操作避免污染。電泳時，恒流200 mA電流轉膜，1.5 h。

1.8.4封閉： 蛋白膜取出后TBS漂洗2 min，TBST室溫條件下封閉1 h。

1.8.5抗體孵育：切蛋白條帶后， 加入TBST稀釋后的一抗緩沖液(NRXN1、NL3和Shank3抗體，1∶3 000；β-actin抗體，1∶3 000)，封口后，4 ℃孵育過夜。

1.8.6二抗孵育：TBST中洗滌5 min，共洗3次，加入二抗緩沖液，4 ℃在側擺搖床孵育1 h(600 r/min)后取出，放入TBST洗滌，洗膜3次，每次10 min。

1.8.7圖像分析：顯色后，使用Image Lab系統進行圖象掃描和結果分析。

1.9 Real-time PCR檢測大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3的mRNA表達水平

取各組大鼠海馬組織樣本，采用RT-PCR檢測大鼠海馬組織中ASD易感基因NL3、NRXN1和Shank3的mRNA表達水平。根據總RNA小量制備試劑盒的步驟提取總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，得到的cDNA按擴增流程進行擴增，在電腦上收集數據的程序是StepOne Software v.2.2.2，在每一個循環中，延伸結束后收集熒光。擴增曲線中，橫坐標為循環數，縱坐標為熒光強度。根據擴增曲線得出每個樣品的Ct值(threshold cycle，Ct值)，由此算出基因的相對表達量(管家基因/參照基因：GAPDH)。引物序列見表1所列。

表1 被測基因引物序列表

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠穿格次數比較

穿格次數：空白對照組>有氧+環境組>有氧運動組>豐富環境組>ASD模型組。與空白對照組相比，有氧+環境組大鼠穿格次數較少，但差異不具有統計學意義(P>0.05)，有氧運動組、豐富環境組及ASD模型組的穿格次數較少且差異具有統計學意義(P<0.05)，其中ASD模型組差異顯著(P<0.01)；與ASD模型組比較，有氧運動組、豐富環境組及有氧+環境組的穿格次數明顯增加(P<0.05)；有氧運動組、豐富環境組及有氧+環境組三組間比較無顯著差異(P>0.05)。見表2所列。

表2 各組大鼠曠場實驗穿格次數的比較

2.2 各組大鼠逃避潛伏期比較

較ASD模型組，有氧運動組、豐富環境組和有氧+環境組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；較空白對照組，其余各組逃避潛伏期延長(P<0.05，P<0.01)；有氧運動組、豐富環境組和有氧+環境組三組間比較無顯著差異(P>0.05)，結果見表3所列。

表3 各組大鼠逃避潛伏期比較

2.3 各組大鼠原平臺所在象限活動時間比較

原平臺所在象限活動時間：空白對照組>有氧+環境組>有氧運動組>豐富環境組>ASD模型組。相較于空白對照組相比，有氧組及有氧+環境組大鼠穿原平臺所在象限活動時間較短，但差異不具有統計學意義(P>0.05)，豐富環境組及ASD模型組的原平臺所在象限活動時間明顯縮短(P<0.05)；相較于ASD 模型組，其余4組大鼠在原平臺所在象限游泳時間延長(P<0.05);有氧運動組、豐富環境組、有氧+環境組三組間比較無顯著差異(P>0.05)。結果見表4所列。

表4 各組大鼠原平臺象限活動時間比較

2.4 各組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白表達水平

與空白對照組比較，ASD模型組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)；干預后，與ASD模型組比較，有氧運動組、豐富環境和有氧+環境組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白表達水平升高(P<0.05)，如圖1～圖4所示。

圖1 各組小鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白表達電泳圖

圖2 各組小鼠海馬組織中NRXN1蛋白表達水平

圖3 各組小鼠海馬組織中NL3蛋白表達水平

圖4 各組小鼠海馬組織中Shank3蛋白表達水平

2.5 各組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3 mRNA表達水平

與空白對照組比較，ASD模型組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3 mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)；干預后，與ASD模型組比較，有氧運動組、豐富環境和有氧+環境組大鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3的mRNA表達水平升高(P<0.05)。如圖5～圖7所示。

圖5 各組小鼠海馬組織中NL3 mRNA表達水平

圖6 各組小鼠海馬組織中NRXN1的mRNA表達水平

圖7 各組小鼠海馬組織中Shank3的mRNA表達水平

3 討論

本研究以VPA誘導的ASD模型鼠作為研究對象，此類模型在國內外針對自閉癥譜系障礙的相關研究中被廣泛應用[8]，具有建模方法易操作、發病機制與人體患自閉癥譜系障礙機制相似[9]的優點；選取有氧運動、豐富環境刺激及二者結合作為干預手段，選取有氧運動作為干預手段是因為大量研究結果顯示適量有氧運動可促進認知控制力發展、促進大腦認知健康[10]，體育運動干預作為一種便捷的自閉癥康復手段，不僅可以調節自閉癥患者的身體，還能有效地提高自閉癥患者的自信心，讓自閉癥患者更好地融入社會[11]，而目前國內針對運動干預改善自閉癥患兒相關癥狀的研究[12]較為少見，其具體干預效果與機制仍需進一步的實驗驗證。

本團隊前期研究結果證明游泳運動、豐富環境及二者結合可以顯著提高PSD-95在自閉癥大鼠海馬的表達水平，PSD-95作為功能橋蛋白可將NRXN-NLGN-SHANK間相互連接起來，主要參與調節NRXN-NLGN-SHANK信號通路。有研究顯示，自閉癥大鼠海馬NL3蛋白表達與抑制性突觸傳遞能力呈負相關[13]，PSD-95的表達則會抑制因NL3蛋白誘導造成的抑制性突觸的變化，當PSD-95與NL3共同表達則可平衡興奮性突觸與抑制性突觸。與NL3相關的神經環路(NRXN-NLGN-SHANK)[14]的興奮，緩解了相關突觸的興奮性與抑制性的失衡，影響海馬區突觸可塑性，并表現為認知功能和學習記憶能力的提高。NL3可與突觸前膜的NRXN相互作用，還可與突觸后Shank蛋白結合。其中，Shank3高表達于海馬，其主要作用是促進樹突棘形成、成熟，是形成功能性突觸的必要基因。NRXN主要與突觸的發生與發育、興奮-抑制性突觸的比例以及功能有關。自閉癥譜系障礙患者普遍存在NRXN1錯義突變。

本研究結果表明有氧運動、豐富環境及二者結合都可使ASD模型鼠海馬組織中NRXN1、NL3和Shank3蛋白的mRNA表達上調，NRXN1、NL3和Shank3均處于NRXN-NLGN-SHANK信號通路中，且均為自閉癥的易感基因。行為學實驗結果顯示經有氧運動、豐富環境及二者結合干預的ASD模型鼠的運動協調能力、探究行為能力、空間記憶能力、空間學習能力等認知能力均有所提高，其自閉癥核心癥狀，如社交障礙、重復刻板行為有明顯改善，這可能與有氧運動、豐富環境及二者結合干預引發NRXN-NLGN-SHANK通路主要基因NRXN1、NL3和Shank3的變化，促進NRXN-NLGN-SHANK通路興奮，矯正突觸中興奮和抑制電流不平衡，從而促進突觸的形成及發育有關。

自閉癥的致病機制復雜多樣，本研究為有氧運動、環境刺激及二者結合治療自閉癥提供新的理論基礎和實驗依據，為研發可改善自閉癥核心癥狀的干預手段提供思路，為基因通路治療自閉癥提供了新的治療策略，為“體醫結合”提供新的推進思路。