LncRNA SNHG7靶向調節miR-146a-5p對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和細胞凋亡的影響*

趙 夢，汪玉寶△，邵 婧，楊 梅

（湖北省鄂州市中心醫院 1.全科醫學科；2.消化內科，鄂州 436000）

胃癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，早期胃癌主要通過手術治療，但多數患者確診時已屬中、晚期，其惡性程度高，預后差[1]。靶向治療給晚期胃癌患者帶來了希望，已有部分靶向藥物用于胃癌的治療，但仍需研發更多新的靶向藥物[2]。研究表明，非編碼RNA 微小RNA（miRNA）及長鏈非編碼RNA（lncRNA）均參與了胃癌的發生發展過程，且lncRNA還可作為競爭性內源RNA（ceRNA）與靶基因競爭結合miRNA，進而參與調控胃癌進程[3]。研究發現，長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因7（lncRNA SNHG7）在胃癌組織中高表達[4]。干擾SNHG7 表達通過調節P15 和P16 抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡且可抑制體內腫瘤的生長[5]。抑制SNHG7 表達可抑制宮頸細胞的增殖和侵襲，且與患者預后相關[6]。研究報道miR-146a-5p 通過靶向Rho 相關的含卷曲螺旋蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1，ROCK1）誘導非雄激素依賴性前列腺癌細胞凋亡[7]。miR-146a-5p過表達顯著抑制了乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移[8]。miR-146a-5p在胃癌中低表達，與腫瘤發生密切相關，可用于胃癌的診斷和預后[9]。且研究發現miR-146a-5p 在具有高腹膜轉移潛能的胃癌細胞中表達下調[10]。然而，miR-146a-5p對胃癌細胞惡性生物學行為的應激尚未可知，SNHG7 對胃癌細胞遷移、侵襲的影響及其機制是否與miR-146a-5p 有關尚不清楚。本實驗旨在研究SNHG7 是否通過調控miR-146a-5p 影響胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡，以期為胃癌的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 選取湖北省鄂州市中心醫院2015年1月至2018年1月接收的患者23例，其中男13例，女10例，所有患者經病理診斷確為胃癌，術前均未接受過放、化療治療，臨床病例資料完整，手術切除癌組織，樣本收集經患者同意且簽署知情同意書。

1.1.2 細胞與試劑 正常胃黏膜上皮細胞GES-1和胃癌細胞NCI-N87、Hs-746T、NCI-SNU-16 購自ATCC；RPMI-1640 培養基購自北京澤平科技有限責任公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；MTT 試劑盒、Annexin VFITC/PI試劑盒購自美國Sigma公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 人正常胃黏膜上皮細胞GES-1和胃癌細胞NCI-N87、Hs-746T、NCI-SNU-16用RPMI-1640 培養液（含10%胎牛血清）培養；取對數生長期細胞NCI-N87，將SNHG7 干擾質粒（si-SNHG7）及其陰性對照（si-NC）分別轉染至NCIN87中，記為si-SNHG7組、si-NC組；將si-SNHG7分別與anti-miR-NC、anti-miR-146a-5p 共轉染至NCIN87 中，記 為si-SNHG7+anti-miR-NC 組、si-SNHG7+anti-miR-146a-5p組。

1.2.2 隨訪 以患者術后出院為觀察起始，定期對患者進行電話隨訪同時結合患者復診病歷，隨訪內容包括有無復發、生存結局、生存時間，隨訪時間截止于2019 年5 月，紀錄患者生存時間并計算生存率。

1.2.3 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）檢測SNHG7 和miR-146a-5p 的表達水平 提取組織及細胞總RNA，合成cDNA，按照說明書操作進行PCR，循環條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環；相對表達量用2-△△Ct法計算。SNHG7 上游引物序列：5’-CTAGGGGACTGGGCTGCT-3’，下游：5’-AGGGTCTTAGGTTCCAGGCA-3’；β-actin上游引物序列：5’-CTCCATCCTGGCTCGCTGT-3’，下游：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’；miR-146a-5p 上游引物序列：5’-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGATGTTTAT-3’，下游：5’-CCTCGAGTCATTAAAGTGATTTCTCCCAAG-3’；U6 上游引物序列：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，下游：5’-CG-CTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 MTT 檢測細胞活力 收集細胞，按MMT 試劑盒說明書操作，每孔分別加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培養箱中繼續孵育4 h 后棄去上清液，每孔加入DMSO150 μL，振蕩反應10 min 使沉淀溶解，最后用酶標儀檢測490 nm處吸光度（A）值。以A值表示細胞活力。

1.2.5 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲 將細胞在無血清的培養液中饑餓12～24 h，終止消化后離心去除培養液，調整細胞濃度為5×105/mL；細胞遷移實驗：將200 μL細胞懸液和600 μL RPMI-1640培養液分別添加到Transwell 的上室和下室，培養24 h，取出小室并吸除培養液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS溶液沖洗2次，室溫下加入0.1%結晶紫染色30 min，沖洗2次，用無菌棉球輕輕擦去上室表面細胞，微鏡下觀察并拍照。細胞侵襲實驗：用Matrigel 包被Transwell上室，其余與細胞遷移實驗步驟相同。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞，用預冷的PBS 漂洗2 次，然后加入10 μL 的Annexin VFITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min；上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 蛋白質印跡（Western blotting）法檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達 提取細胞總蛋白，用BCA 定量。取40 μg 蛋白樣品進行SDSPAGE，先用90 V 電壓跑30 min，再用120 V 電壓跑2 h，然后經電轉將蛋白轉移至PVDF上；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 多克隆抗體（1∶800），4 ℃冰箱孵育過夜，PBS 洗滌3 次，5 min/次；再加入山羊抗兔IgG-HRP（1∶1 200）室溫孵育2 h，PBS 洗滌3 次，10 min/次，加入化學發光液顯影，定影，成像后用Quantity One檢測蛋白條帶灰度值，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.2.8 熒光素酶報告實驗檢測SNHG7對miR-146a-5p 的靶向調控 starBase 數據庫顯示SNHG7 與miR-146a-5p存在結合位點。構建SNHG7的野生型和突變型熒光素酶表達載體，將其分別與miR-NC和miR-146a-5p 共轉染至細胞NCI-N87 中，按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA SNHG7在胃癌細胞株中的表達情況

與人正常胃黏膜上皮細胞GES-1 相比，胃癌細胞NCI-N87、Hs-746T、NCI-SNU-16 中LncRNA SNHG7表達水平顯著升高（P＜0.05），見表1。根據所有患者組織標本中檢測的SNHG7 的平均表達量，將其分為高表達和低表達組，LncRNA SNHG7高表達的患者生存率低于低表達的患者生存率，見圖1。

表1 胃癌細胞株中LncRNA SNHG7的表達 ，n=9

表1 胃癌細胞株中LncRNA SNHG7的表達 ，n=9

與人正常胃黏膜上皮細胞GES-1相比，*P＜0.05。

圖1 LncRNA SHNG7高表達和低表達患者的生存率（n=23）

2.2 LncRNA SNHG7 的敲減對胃癌細胞NCI-N87的增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

與si-NC 組相比，si-SNHG7 組胃癌細胞NCIN87 中SNHG7 表達水平降低，細胞活力降低，細胞遷移、侵襲數降低，細胞凋亡率升高，E-cadherin 蛋白表達水平升高，N-cadherin 蛋白、Vimentin 蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖2、圖3和表2、表3。

表2 lncRNA SNHG7的敲減對NCI-N87細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 ，n=9

表2 lncRNA SNHG7的敲減對NCI-N87細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 ，n=9

表3 LncRNA SNHG7的敲減對NCI-N87的遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

表3 LncRNA SNHG7的敲減對NCI-N87的遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

圖2 LncRNA SNHG7敲減對NCI-N87細胞凋亡的影響

圖3 LncRNA SNHG7的敲減對NCI-N87的遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

2.3 LncRNA SNHG7 靶向miR-146a-5p，抑制miR-146a-5p的表達

starBase3.0 網站預測顯示，LncRNA SNHG7 與miR-146a-5p 有結合位點，見圖4。與miR-NC 組相比，miR-146a-5p組轉染野生型表達載體的NCI-N87細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），見表4。抑制SNHG7 表達后miR-146a-5p 表達水平升高（P＜0.05），見表5。

圖4 LncRNA SNHG7與miR-146a-5p的結合位點

表4 NCI-N87 細胞中lncRNA SNHG7 與miR-146a-5p 的靶向關系 ，n=9

表4 NCI-N87 細胞中lncRNA SNHG7 與miR-146a-5p 的靶向關系 ，n=9

表5 NCI-N87 細胞中lncRNA SNHG7 的敲減對miR-146a-5p的表達的影響 ，n=9

表5 NCI-N87 細胞中lncRNA SNHG7 的敲減對miR-146a-5p的表達的影響 ，n=9

2.4 miR-146a-5p在胃癌細胞株中的表達

與人正常胃粘膜上皮細胞GES-1 相比，胃癌細胞NCI-N87、Hs-746T、NCI-SNU-16 中miR-146a-5p表達水平顯著降低（P＜0.05），見表6。

表6 胃癌細胞株中miR-146a-5p的表達 ，n=9

表6 胃癌細胞株中miR-146a-5p的表達 ，n=9

與人正常胃黏膜上皮細胞GES-1相比，*P＜0.05。

2.5 抑制miR-146a-5p 的表達逆轉了敲減SNHG7對NCI-N87細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

與si-SNHG7+anti-miR-NC 組相比，si-SNHG7+anti-miR-146a-5p 組miR-146a-5p 表達水平降低，細胞活力升高，細胞遷移、侵襲數升高，細胞凋亡率降低，E-cadherin 表達水平降低，N-cadherin 蛋白、Vimentin蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖5、圖6和表7。

圖5 抑制miR-146a-5p表達逆轉敲減lncRNA SNHG7對NCI-N87細胞凋亡影響

圖6 抑制miR-146a-5p 表達逆轉敲減lncRNA SNHG7 對NCI-N87細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

表7 抑制miR-146a-5p表達逆轉敲減lncRNA SNHG7對NCI-N87細胞和遷移和侵襲的影響 ，n=9

表7 抑制miR-146a-5p表達逆轉敲減lncRNA SNHG7對NCI-N87細胞和遷移和侵襲的影響 ，n=9

與si-NC組相比，*P＜0.05;與si-SNHG7+anti-miR-NC組相比，#P＜0.05。

3 討論

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤，發病率較高，現有的胃癌治療手段有限，手術和放療、化療方法還未能達到理想效果，亟需新的治療方法[11]。研究表明，lncRNA 參與胃癌的發生發展過程，在胃癌診斷、靶向治療和預后等方面具有廣闊前景[12]。研究報道，SNHG7 在乳腺癌組織中顯著上調，抑制SNHG7 可以抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲[13]。敲低SNHG7 抑制了肝癌細胞在體外的增殖，遷移和侵襲[14]。SNHG7通過調節miR-34a抑制骨肉瘤中細胞活力，遷移和侵襲以及EMT，誘導細胞凋亡[15]。lncRNA SNHG7 通過增強Fas 凋亡抑制分子2（Fasapoptotic inhibitory molecule 2，FAIM2）表達來促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制其凋亡[16]。以上研究表明，lncRNA SNHG7 參與調控多種腫瘤的發生發展進程，其多作為促癌基因起作用；但其對胃癌細胞的影響尚不其清楚。本實驗首先用qPCR檢測胃癌細胞中SNHG7的表達水平，結果發現SNHG7 高表達，且生存曲線結果顯示，SNHG7 高表達的患者生存率低（P＜0.05），說明SNHG7 在胃癌中也起促癌基因作用，其可能影響患者預后。將抑制SNHG7表達載體轉染至胃癌細胞中，檢測細胞惡性生物學行為，結果顯示，細胞活力以及細胞遷移、侵襲數降低，細胞凋亡率升高，E-cadherin表達水平升高，N-cadherin、Vimentin 表達水平降低（P＜0.05）。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 是EMT 過程中的標記物，EMT 與胃癌細胞體內轉移有關，細胞遷移侵襲能力增強時N-cadherin、Vimentin 表達水平升高[17]。說明抑制SNHG7表達可抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和EMT，并促進細胞凋亡；其在胃癌中的作用與在其他癌癥中作用相似。

研究報道，miR-146a-5p 在顱內動脈瘤患者的血漿樣本中高表達，與患者預后相關[18]。miR-146a-5p 可以抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制間充質標記N-cadherin、Vimentin 的表達并增加上皮標記E-cadherin的表達[19]。miR-146a-5p過表達還增強了人參皂苷Rh2誘導的肝癌細胞凋亡和抗增殖作用[20]。以上研究表明，miR-146a-5p在多種癌癥中起抑癌基因作用，且影響患者預后。qPCR結果顯示，胃癌細胞中miR-146a-5p 低表達（P＜0.05），表明miR-146a-5p 在胃癌中可能也起抑癌作用。本實驗的雙熒光素酶結果表明，SNHG7靶向調控miR-146a-5p。此外，抑制miR-146a-5p 表達逆轉了抑制SNHG7表達對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響（P＜0.05），提示SNHG7 可能通過調控miR-146a-5p 影響胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡。

綜上所述，抑制SNHG7 表達可能通過上調miR-146a-5p 表達抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡。