高糖通過上調E2F1的表達促進肝癌細胞的侵襲和轉移*

林 楚，劉凱麗，王 瀟，蒙麗恒，秦映芬

（廣西醫科大學第一臨床醫學院，南寧 530021）

原發性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上比較多見的一種腫瘤性疾病，每年因此疾病而死亡的人數約占全世界總死亡數的一半以上[1]。根據目前的研究可知，2 型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）與肝癌發生之間具有明確的相關性，T2DM患者患肝癌的風險可以增加大約2.5倍[2-4]。作為糖尿病的早期表現，血糖水平的升高可能直接調節腫瘤相關信號通路，特別是滿足癌細胞對高糖的需求[5-6]，提示高糖可促進肝臟腫瘤形成的能力。轉移是惡性腫瘤導致死亡的主要因素。肝癌發生轉移后，5 年存活率不足15%[7]。大量證據顯示，肝細胞由惡性發展到肝癌，以及癌細胞脫落并獲得遷移和侵襲能力的所有過程中均可發生上皮—間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）[8-11]。EMT是肝癌發展及侵襲轉移的原始動力。此外，大量的研究發現，在高糖環境下，不論是正常細胞還是癌細胞都可能發生EMT 的改變[12-13]。然而，在高糖環境下肝癌細胞發生EMT的機制尚不清楚。

轉錄因子E2F1（E2F transcription factor 1，E2F1）作為新陳代謝的調節器可參與維持機體代謝與穩態的所有組織的發育及分化過程[14]。近年來，E2F 家族的轉錄因子對腫瘤的影響也逐漸被報道。研究報道[15]，高糖可以刺激E2F1 的表達，并通過促進E2F1/RRBP1信號通路的激活可加速肝癌細胞的增殖和轉移。E2F1 調控著肝癌的惡性發展過程[16-18]，但是關于高糖條件下E2F1 如何促進肝癌發展尚不可知，E2F1 能否對肝癌早期轉移標志的EMT產生影響，更是未見相關報道。本研究旨在探討高糖條件下E2F1與Huh-7肝癌細胞EMT的相關關系，并初步探索可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養

人Huh-7肝癌細胞購于中科院上海細胞庫。人Huh-7 肝癌細胞培養在包含有DMEM 完全培養基3～5 mL 的培養瓶中，用含胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM 培養Huh-7 細胞。放于37 ℃恒溫5%CO2的溫箱中。

1.2 細胞轉染

選用的siRNA 靶序列：GAGACCTCTTCGACTGTGA。為了獲得E2F1 沉默的Huh-7 細胞，根據制造商的說明書采用riboFECT?CP Reagent 的轉染試劑對Huh-7細胞進行轉染。

1.3 細胞活力測定

采用CCK-8試驗測定細胞活力。將Huh-7細胞鍍在96孔板中。轉染后，細胞培養為分別為0 h、24 h、48 h 和72 h，然后在每個孔中加入10 μL CCK8（10 mg/mL），孵育2 h，在450 nm的測試波長下檢測吸光度。

1.4 蛋白質印跡法（Western blotting）

細胞在添加PMSF 的RIPA 緩沖液中裂解，用SDS-PAGE分離蛋白裂解液并轉移到PVDF膜。在此之后，在5%脫脂牛奶緩沖液中室溫孵育2 h，4 ℃搖床孵育一晚。用TBST緩沖液洗滌3次，PVDF膜與二抗孵育放在室溫下搖床1～2 h即可。然后采用ECL試劑盒對目的條帶進行曝光顯影，在Image J軟件中對條帶的灰度值進行計算，目的蛋白/內參灰度值的比值便是相應的相對蛋白表達量。

1.5 逆轉錄定量PCR（RT-PCR）

采用Trizol（America Invitrogen）制備總RNA。采用RNA 逆轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA。實時PCR 引物序列，見表1。應用qPCR 擴增儀（Bio-Rad CFX connect Real-Time System，Bio-Rad，Hercules，CA）進行定量PCR。以GAPDH用作內參。

表1 各引物序及其序列

1.6 侵襲和遷移試驗

采用劃痕實驗和Transwell 侵襲實驗測定細胞的遷移和侵襲能力。對于侵襲試驗，用移液槍混勻DMEM 培養基與Corning Matrigel 膠后吸取100 μL加入到Transwell小室的上室。對下室給予10%FBS的培養基600 μL。培養24 h 后用蘸有PBS 的濕棉簽溫柔地將上室中的細胞擦拭干凈，將小室底面先后放入甲醇及0.1%的結晶紫中各半小時，最后在顯微鏡下觀察侵襲的細胞數并保存照片留檔。對于劃痕試驗，細胞被生長在6 孔板中匯合，在0 h 受傷，并在0 h和48 h的時間點拍照。用移液槍100 μL規格的槍頭劃傷細胞。然后用PBS液清洗，去除游離漂浮的細胞和碎片，在不同糖濃度的DMEM培養基中再培養24 h。最后在Imag J軟件中計算出各組的劃痕愈合率。

1.7 統計學方法

采用SPSS 18.0 軟件進行數據分析。計量資料以平均值±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗或者方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖促進了Huh-7細胞增殖、遷移和侵襲

CCK-8 試驗結果顯示，在0 h 時兩組細胞的吸光度值差異無統計學意義（P＞0.05）；隨著時間的延長，高糖組細胞的吸光度值增長較對照組明顯加快（P＜0.05）（圖1）。Transwell侵襲試驗結果表明，高糖組細胞的侵襲數目明顯多于對照組（圖2）；劃痕試驗顯示，高糖組細胞的劃痕愈合率較對照組增加（P＜0.05）（圖3）。

圖1 兩組細胞在不同時間點的吸光度值

圖2 不同濃度葡萄糖對Huh-7細胞侵襲的影響

圖3 不同葡萄糖濃度對Huh-7細胞遷移能力的影響

2.2 高糖條件下加速了Huh-7細胞的EMT過程

與對照組相比，高糖組EMT 相關標志物（βcatenin、Vimentin、α-SMA）表達升高（P＜0.05）（圖4）。

圖4 不同葡萄糖濃度下EMT的表達情況

2.3 高糖下E2F1表達情況

對照組和高糖組分別培養Huh-7 細胞48 h。Western blotting 和RT-PCR 結果顯示，高糖組E2F1相對蛋白表達量明顯高于對照組（P＜0.05）（圖5）；高糖組E2F1 mRNA水平高于對照組（P＜0.05）。

圖5 不同葡萄糖濃度下E2F1的表達

2.4 高糖通過上調E2F1促進Huh-7細胞EMT和侵襲、遷移

在高糖環境下，培養沉默E2F1 的Huh-7 細胞為HG+SIE 組，未沉默E2F1 的Huh-7 細胞為HG+NC 組。分別對兩組細胞進行Transwell 侵襲、遷移試驗，結果表明，HG+SIE組細胞的侵襲數和遷移數均少于HG+NC 組細胞的侵襲數（P＜0.05）（圖6、圖7）。用Western blotting 和RT-PCR 實驗方法檢測細胞中EMT 相關標記物（E-cadherin、Vimentin、α-SMA）的表達，結果表明，HG+SIE組細胞中EMT相關標志物的表達較HG+NC組下降（P＜0.05）（圖8）。

圖6 E2F1對Huh-7細胞侵襲性的影響

圖7 E2F1對Huh-7細胞遷移的影響

圖8 E2F1對EMT表達的影響

3 討論

糖尿病的發病率越來越高，預計到2045年將有近7 億人受到糖尿病的影響。而HCC 將成為全球第6 大最常見診斷癌癥和第4 大癌癥相關死亡原因[19]。超過一半的新診斷癌癥病例和死亡病例發生在中國[1,20-22]。因此，中國作為糖尿病及肝癌的高發區，糖尿病與肝癌的關系理應給予更多的關注。本研究發現，高糖可促進Huh-7細胞的增殖，并且通過Transwell 侵襲試驗和劃痕試驗也提示高糖可促進肝癌細胞的侵襲和轉移能力，與既往的研究結果相似。

E2F1可以參與對癌細胞的代謝重組，與腫瘤進展、轉移和預后密切相關，為重要的促癌因子[18]。有文獻報道，在小細胞肺癌的進程中，E2F1 參與調控其中的侵襲和轉移過程[23]；在對腎細胞癌的研究中發現，E2F1 表達上調可加速細胞周期中G1/S 期的轉變，使癌細胞的增值、遷移和侵襲作用增強[24]；在通過對E2F1 轉基因小鼠的研究中也觀察到其肝臟中腫瘤的形成[25]。雖然E2F1 在肝癌中的作用已被公認，但E2F1調控肝癌的機制卻是復雜多樣的。研究表明，E2F1 可以通過Cyclin E1/E2、Pin-1、SKP2、EZH2/CCRK、miR429/RBBP4 等作用促進肝癌細胞的增殖及生長[9,26]。此外，過表達的E2F1 還可通過調節H19使肝癌細胞HepG2的侵襲能力增加[27]。本研究結果顯示，Huh-7肝癌細胞在高糖環境中E2F1的表達量相對于正常糖濃度培養的細胞中表達上調，再次證實了高糖對E2F1的促進作用。

EMT 在人體中主要參與胚胎形成、器官發育、組織愈合，同時也參與腫瘤的發生和轉移，通過改變細胞間相互作用和細胞與基質間的相互作用，促進腫瘤細胞侵襲和運動[28]。EMT 通常伴隨著間充質細胞特有的蛋白質表達（比如β-catenin，Vimentin、α-SMA）和上皮標志物的丟失（比如E-cadherin）[29]。如前所述，本研究結果發現高糖促進了Huh-7 細胞侵襲和遷移能力，并且證實了高糖對E2F1 的促進作用。但E2F1 和EMT 的關系尚不清楚。本研究中將Huh-7細胞培養于不同糖濃度的培養基中，通過Transwell 侵襲試驗結果表明，高糖環境僅可以加強Huh-7 細胞的侵襲遷移能力，而且EMT 相關指標（E-cadherin、Vimentin、α-SMA）的表達水平均增加。雖然在經典的EMT過程中，通常被定義為E-cadherin等指標的丟失和Vimentin等指標的上調，本研究中高表達的E-cadherin 似乎與既往典型EMT標志物的改變相矛盾，但仍有大量的研究結果與此結論并不一致甚至相反。在對乳腺癌和唾液腺癌的分析中顯示，E-cadherin 的表達與腫瘤的侵襲性之間并不存在完全的相關關系[30-31]。雖然在腫瘤巢邊緣和多細胞簇浸潤前沿的癌細胞中，Ecadherin 是呈現較低表達的狀態，但在實體腫瘤巢中心的癌細胞中卻幾乎是正常表達E-cadherin[32]。甚至一些晚期癌癥在表達細胞間質性改變的同時，也保留E-cadherin高表達水平以及高度分化的上皮細胞的特征[30]。從最近Karaosmano?lu 等[33]的研究中也發現，Huh-7肝癌細胞中，Slug介導細胞在發生EMT 過程時呈現出E-cadherin 表達的升高，其分子的改變也和經典的EMT并不相同。此外，有證據表明，EMT 可以分為部分性EMT[34]和完全性EMT[35]。當細胞經歷完全性EMT 時，以E-cadherin 為代表的上皮性“開關”將會完全喪失；然而，當細胞發生部分性EMT 時，并非所有的上皮特征（如E-cadherin）完全被間質特征的標記物（如Vimentin）所取代，而是出現的一個同時表達的共存現象。因此，當細胞發生部分性EMT時，可在上皮特征不完全喪失或間質特征不完全獲得的情況下便啟動轉移[37]。有研究發現，肝細胞生長因子誘導的犬腎MDCK細胞在發生部分性EMT 過程中，E-cadherin 的表達也可呈現瞬時性上調，說明E-cadherin 的上調是可參與至EMT的發生[41]。為探討在高糖條件下Huh-7肝癌細胞EMT 的發生是否由E2F1 介導，本研究采用沉默Huh-7肝癌細胞中E2F1的表達，以便進一步探討二者之間的關系。研究結果顯示，在高糖環境中，將細胞中E2F1 沉默后，與對照組相比，Huh-7 肝癌細胞的侵襲和遷移能力都隨之減弱，同時EMT相關標志物Vimentin、α-SMA 的表達也出現降低，綜合本研究結果得知在高糖的條件下細胞中E2F1 可介導EMT 的發生，但其中的分子機制還有待進一步研究。

本研究仍然存在一些不足之處。首先，本研究結果均只在細胞層面上進行驗證，且也僅限于Huh-7肝癌細胞。其次，與眾多研究相符，本研究顯示高糖時細胞在功能上發生EMT的改變，但是在分子層面上細胞發生EMT 時E-cadherin 的結果卻與多數研究不盡相同，后續可以在此方面進行更深入的探索。

綜上所述，本研究證實高糖可通過上調E2F1，促進EMT增強Huh-7細胞的增殖和轉移，為后續肝癌及糖代謝相關關系的研究提供了可靠理論基礎。