lncRNA GABPB1-IT1靶向下調miR-501抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移的機制*

趙丹華，田艷杰，李秋爽，劉 麗，李翠英，孫靜莉

（1.鐵嶺市婦嬰醫院婦產科，鐵嶺 112000；2.北部戰區總醫院婦產科，沈陽 110016）

宮頸癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤，是僅次于乳腺癌的女性第二大惡性腫瘤[1]。宮頸癌患者死亡的重要原因是治療失敗、轉移及復發，尋找有效途徑提高宮頸癌患者的生存時間是目前亟待解決的問題[2]。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是一類在哺乳動物基因組DNA 中獲得的沒有編碼蛋白質作用的RNA，長鏈ncRNA（long non-coding RNA，lncRNA）是非編碼RNA 中十分重要的一部分，其長度大于200 nt，參與基因印記、染色質修飾、基因表達調控等過程[3]。很多的實驗已經發現，lncRNA 的作用廣泛，不僅在細胞增殖、代謝、炎癥反應等過程中發揮作用，還參與心血管系統疾病、神經退行性疾病、腫瘤等進程[4-6]。lncRNA 在腫瘤組織中表達改變，而且lncRNA 調控腫瘤細胞的遷移和侵襲，對腫瘤患者的康復有重要意義[7]。GA結合蛋白轉錄因子亞基β1-內含子轉錄本1（GA binding protein transcription factor subunit beta 1-intronic transcript 1，GABPB1-IT1）是新近研究發現的與腫瘤有關的lncRNA，非小細胞肺癌中GABPB1-IT1表達下調，GABPB1-IT1 能夠抑制腫瘤細胞的生長[8]。目前對于GABPB1-IT1 在宮頸癌中的作用還不明確。lncRNA 作用機制與miRNA 關系密切，二者通過堿基互補的方式結合，lncRNA 影響微小RNA（microRNA，miRNA）表達進而發揮多種生物學作用[9]。前期預實驗已經發現GABPB1-IT1 和miR-501 存在互補結合位點。miR-501 是一個具有促進腫瘤進展的小分子RNA，在宮頸癌中已經證明miR-501誘導腫瘤轉移和生長[10]。本研究探討GABPB1-IT1對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用及機制，為基因治療宮頸癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌HeLa、Caski、SiHa細胞購自上海艾研生物科技有限公司；pcDNA-GABPB1-IT1、pcDNA、miR-501 mimics、mimics control 購自和元生物技術(上海)股份有限公司；N-cadherin抗體購自美國Cell Signaling Technology；正常宮頸上皮Ect1/E6E7細胞購自上海欽誠生物科技有限公司；基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）抗體、E-鈣粘蛋白（E-cadherin）抗體購自美國Proteintech；MMP-9抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司。

1.2 qRT-PCR 方法檢測宮頸癌細胞中GABPB1-IT1表達水平

取處于對數生長期的宮頸癌HeLa、Caski、SiHa細胞和正常宮頸上皮Ect1/E6E7 細胞，在細胞中加入Trizol 試劑，提取細胞總RNA。取3 μg 的RNA，加入1 μL 的Oligo dT primer、1 μL 的dNTP，繼續加入DEPC 水至10 μL，將上述體系放在65 ℃水浴中孵育5 min，然后置于冰上靜置2 min。繼續加入4 μL 的5×Prime Script Buffer、1.6 μL Prime Script RTase、0.5 μL 的RNase inhibitor，添加DEPC 水至20 μL，放在42 ℃孵育1 h，95 ℃孵育5min，置于冰上冷卻5 min。取50 ng 的cDNA、1 μL 的上游引物以及下游引物、12.5 μL 的SYBR Premix Ex Taq II，加入ddH2O 至25 μL，PCR 反應程序：95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，共設置40個循環。以GAPDH作為內參，按照公式2-△△Ct法計算GABPB1-IT1表達水平。引物序列為：GABPB1-IT1 上游（5’-3’）ACCCACAGACAACTGTGGACCC，下游（3’-5’）GCCGCCCCTATTGTTGCCCA；GAPDH 上游（5’-3’）CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA，下游（3’-5’）GGGTGGAATCATATTGGAACATGT。

1.3 實驗分組和轉染

宮頸癌SiHa 細胞接種到12 孔板，細胞密度達到60%時，進行細胞轉染，分別將pcDNA-GABPB1-IT1、pcDNA 轉染到細胞內，細胞轉染方法按照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書進行。把轉染pcDNA-GABPB1-IT1、pcDNA 后的宮頸癌SiHa 細胞設置為GABPB1-IT1 組、Vector 組。將沒有轉染的細胞設置為Control 組。Control 組、Vector 組、GABPB1-IT1 組細胞培養24 h 以后，根據“1.2”項中qRT-PCR方法檢測GABPB1-IT1表達水平。

1.4 CCK-8方法檢測細胞增殖

宮頸癌SiHa 細胞按照每個孔中150 μL 細胞培養液、3 000個細胞種植到96孔板中，然后按照Control、Vector、GABPB1-IT1 組分組方法處理，置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養24 h以后，將培養板取出，分別加入10 μL 的CCK-8，繼續反應2 h。酶標儀測定每個樣品孔450 nm 的OD 值。計算細胞存活率（對照組細胞存活率為100%）。

1.5 Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲

細胞侵襲實驗前需要將小室包被，步驟如下：將基質膠和DMEM按照1∶7的比例混合，然后吸取60 μL 添加到Transwell 小室中，放在37 ℃孵育，觀察基質膠凝固以后備用。將Control 組、Vector 組、GABPB1-IT1 組以不含血清的細胞培養液懸浮，吸取200 μL的細胞溶液添加到小室的上室中，在下室中添加500 μL 的含血清細胞培養液。將小室放在37 ℃培養24 h 后，將沒有穿膜的細胞擦掉，以PBS洗滌。無水甲醛固定，0.1%的結晶紫染色，在顯微鏡下觀察細胞遷移和侵襲數目。

1.6 Western blotting 檢測MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達

收集培養24 h 以后的Control 組、Vector 組、GABPB1-IT1 組細胞，添加RIPA 溶液，放在冰上裂解20 min，用細胞刮將細胞刮下，冰浴，超聲5次，每次1 s，間隔2 s。4 ℃，12 000 g 離心10 min，吸取上清溶液轉移到新的EP 管內，以二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）方法測定樣品的濃度。分別制備10%的分離膠和5%的濃縮膠。蛋白在添加到上樣孔以前需要和等體積的2×上樣緩沖液煮沸5 min。設置80 V 的電壓電泳，觀察溴酚藍快要進入分離膠時，將電壓設置為120 V 繼續電泳。電泳結束后，將硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜根據凝膠的大小裁剪。利用三明治法進行轉膜，轉膜電壓為90 V，轉膜90 min 以后，將NC 膜放在5%脫脂奶粉溶液中，低速室溫搖床孵育2 h。將一抗和二抗分別用TBST 稀釋，一抗按照1∶1 000 稀釋，二抗按照1∶2 000稀釋。NC膜置于一抗中，室溫結合2 h，NC膜置于二抗中，室溫結合2 h。增強型化學發光（enhance chemiluminescence，ECL）顯色。Biod-Rad 顯影。分析條帶的灰度值，內參為GAPDH，對蛋白進行半定量分析。

1.7 GABPB1-IT1 靶向關系預測及熒光素酶系統鑒定靶向關系

利用starbase 數據庫對GABPB1-IT1 的靶基因進行分析，通過熒光素酶報告系統鑒定靶向關系。將野生型（wild type，WT）和突變型（mutant type，MUT）分別同miR-501 mimics、mimics control 共轉染到宮頸癌SiHa 細胞中，培養24 h 以后，熒光素酶活性測定試劑盒檢測熒光素酶活性變化。WT 和MUT 分別是含有GABPB1-IT1 結合位點的野生型熒光素酶報告載體和含有突變之后的GABPB1-IT1結合位點的突變型熒光素酶報告載體。收集培養24 h以后的Control組、Vector組、GABPB1-IT1組細胞，以qRT-PCR 方法檢測miR-501 表達水平，U6 為內參，按照miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進行反轉錄，反轉錄體系包含：110 μL 的2×miRNA L-RT Solution mix、1 μL 的STem-loop primer、200ng 的RNA、5 μL 的miRNA L-RT Enzyme mix，加RNasefree water 至20 μL，放在16 ℃30 min，37 ℃30 min，85 ℃5 min。利用SYBR Premix Ex Taq miRNA kit進行實時定量PCR，PCR 體系包含：1 μL 的forward以及reverse primer、12.5 μL 的SYBR Premix Ex Taq II、1 μL 的cDNA，加ddH2O 至20 μL，在95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，55 ℃30 s，共40 個循環。引物序列為：miR-501 上游（5’-3’）AATGCACCCGGGCAAGGATTCT，下游（3’-5’）AGAATCCTTGCCCGGGTGCATT；U6 上游（5’-3’）GCTTCGGCAGCACATATACT，下游（3’-5’）GTGCAGGGTCCGAGGTATTC。

1.8 miR-501的逆轉作用

宮頸癌SiHa 細胞中分別轉染pcDNA-GABPB1-IT1、miR-501 mimics 和pcDNA-GABPB1-IT1、mimics control，記 為GABPB1-IT1+miR-501 組 和GABPB1-IT1+miR-NC 組。以GABPB1-IT1+miRNC 組為參照，按照“1.2”項中qRT-PCR 方法、“1.4”項中CCK-8、“1.5”項中Transwell 小室、“1.6”項中Western blot 方法分別檢測miR-501 表達水平、增殖、遷移侵襲和MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達水平。

1.9 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件分析進行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GABPB1-IT1在宮頸癌細胞中相對低表達

宮頸癌HeLa、Caski、SiHa 細胞中GABPB1-IT1表達水平低于正常宮頸上皮Ect1/E6E7 細胞（P＜0.05）。宮頸癌HeLa、Caski 細胞中GABPB1-IT1 表達水平高于宮頸癌SiHa 細胞（P＜0.05），見表1。GABPB1-IT1在宮頸癌細胞中相對低表達。選擇表達水平最低的宮頸癌SiHa細胞作后續實驗。

表1 宮頸癌HeLa、Caski、SiHa 細胞和正常宮頸上皮Ect1/E6E7細胞中GABPB1-IT1表達水平

表1 宮頸癌HeLa、Caski、SiHa 細胞和正常宮頸上皮Ect1/E6E7細胞中GABPB1-IT1表達水平

與Ect1/E6E7比較，*P＜0.05；與SiHa比較，#P＜0.05。

2.2 pcDNA-GABPB1-IT1上調宮頸癌SiHa細胞中GABPB1-IT1表達水平

與Control組、Vector組比較，GABPB1-IT1組宮頸癌SiHa 細胞中GABPB1-IT1 表達水平升高（P＜0.05），見表2。pcDNA-GABPB1-IT1上調宮頸癌Si-Ha細胞中GABPB1-IT1表達水平。

表2 pcDNA-GABPB1-IT1 轉染以后宮頸癌SiHa 細胞中GABPB1-IT1表達水平

表2 pcDNA-GABPB1-IT1 轉染以后宮頸癌SiHa 細胞中GABPB1-IT1表達水平

與Control組和Vector組比較，*P＜0.05。

2.3 上調GABPB1-IT1對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與Control、Vector 組比較，GABPB1-IT1 組宮頸癌SiHa 細胞存活率降低，細胞遷移和侵襲數目減少，細胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖1，表3。上調GABPB1-IT1降低宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移和侵襲能力。

表3 上調GABPB1-IT1對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移和侵襲的影響

表3 上調GABPB1-IT1對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與Control組和Vector組比較，*P＜0.05。

圖1 上調GABPB1-IT1對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 GABPB1-IT1靶向下調miR-501表達

生物信息學軟件發現，GABPB1-IT1 和miR-501存在互補結合位點，并且miR-501 mimics和WT共轉染以后的細胞熒光素酶活性降低；與Control組、Vector組比較，GABPB1-IT1組宮頸癌SiHa細胞中miR-501表達水平降低（P＜0.05），見圖2，表4，表5。

表4 熒光素酶活性

表4 熒光素酶活性

與mimics control組比較，*P＜0.05。

表5 上調GABPB1-IT1后宮頸癌SiHa細胞中miR-501水平

表5 上調GABPB1-IT1后宮頸癌SiHa細胞中miR-501水平

與Control組和Vector組比較，*P＜0.05。

圖2 GABPB1-IT1和miR-501靶向結合位點

2.5 miR-501 逆轉GABPB1-IT1 對宮頸癌SiHa 細胞增殖、遷移和侵襲作用

與GABPB1-IT1+miR-NC 組比較，GABPB1-IT1+miR-501組宮頸癌SiHa細胞中miR-501水平升高，細胞存活率、細胞遷移數目和侵襲數目均升高，細胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin 蛋白表達水平升高，E-cadherin 蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖3，表6。miR-501 逆轉GABPB1-IT1 對宮頸癌Si-Ha細胞增殖、遷移和侵襲作用。

圖3 miR-501逆轉GABPB1-IT1對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移和侵襲作用

表6 miR-501逆轉GABPB1-IT1對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移和侵襲作用

表6 miR-501逆轉GABPB1-IT1對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移和侵襲作用

與GABPB1-IT1+miR-NC組比較，*P＜0.05。

3 討論

lncRNA 是不具備編碼蛋白質作用的轉錄本，也有一小部分的lncRNA被證實可以編碼一些小的多肽，并且通過這些小多肽發揮功能[11]。相對于編碼蛋白質基因，lncRNA 在組織中的表達豐度較低，并且有細胞和組織特異性，lncRNA 能夠作為骨架、誘餌、信號、向導，通過轉錄以及轉錄后水平、表觀遺傳學水平發揮作用[12]。lncRNA參與人類疾病，其中腫瘤是人們研究的熱點之一。lncRNA 在腫瘤中的表達水平發生改變，lncRNA 通過影響腫瘤細胞的生長、遷移等過程參與調控腫瘤的轉移和進展[13]。在非小細胞肺癌中發現，GABPB1-IT1 表達下調促進腫瘤進展，GABPB1-IT1 可能是一個腫瘤抑制因子[8]。本研究結果顯示，GABPB1-IT1在宮頸癌細胞中表達下調，推測GABPB1-IT1 在宮頸癌中發揮抑制作用，進一步通過細胞增殖實驗發現，上調GABPB1-IT1 后的宮頸癌細胞存活率降低，證明GABPB1-IT1 具有抑制宮頸癌細胞增殖的作用，提示GABPB1-IT1 可能是一個宮頸癌抑制因子，這與以前的研究結果相符合，說明GABPB1-IT1 在腫瘤中可能發揮類似抑癌基因的作用。

很多腫瘤患者死亡的重要原因是腫瘤發生遠端轉移，腫瘤細胞通過向周圍組織中遷移和侵襲形成新的病發灶，加重腫瘤進展[14]。腫瘤轉移過程中，腫瘤細胞能夠產生大量的細胞外基質降解酶，這些蛋白酶能夠分解細胞外基質，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供條件[15]。細胞外基質降解酶種類繁多，基質金屬蛋白酶是常見的細胞外基質降解酶，其含有多個蛋白成員，其中MMP-2 和MMP-9 是目前發現的與腫瘤轉移關系十分密切的細胞外基質降解酶[16]。MMP-2和MMP-9在腫瘤中過度表達，MMP-2 和MMP-9 表達增多被認為是腫瘤細胞轉移能力升高的標志[17]。很多研究報道表明，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤轉移的早期標志事件，EMT水平升高后腫瘤轉移能力也增加[18]。EMT 被定義為上皮細胞特征消失而逐漸表現出間質細胞特征的過程，在人體生理活動如器官發育、組織修復等過程中發揮重要作用，EMT還參與心肌纖維化、腎組織纖維化等病理過程[19-20]。N-cadherin是一個間質細胞標志蛋白，其在腫瘤中高表達[21]。E-cadherin 是一個上皮細胞標志蛋白，其在腫瘤中表達下調[22]。經Transwell小室實驗發現，上調GABPB1-IT1 后的宮頸癌細胞遷移和侵襲數目減少，推測GABPB1-IT1 具有抗宮頸癌細胞遷移和侵襲作用；經Western blotting檢測定表明，上調GABPB1-IT1后的細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平降低，提示GABPB1-IT1 減少了宮頸癌細胞合成細胞外基質降解酶，同時本研究還發現，上調GABPB1-IT1 后的宮頸癌細胞中E-cadherin 蛋白表達水平升高，N-cadherin蛋白表達水平降低，上調GABPB1-IT1降低了宮頸癌細胞EMT水平，提示上調GABPB1-IT1可能通過抑制細胞EMT、減少細胞合成細胞外基質降解酶發揮抗腫瘤遷移和侵襲作用。

目前對lncRNA 發揮作用的機制還未完全闡明，已知其可以通過與miRNA 結合發揮生物學功能。lncRNA 以堿基互補的方式與miRNA 結合，最終影響miRNA的表達，參與不同的病理以及生理過程，一個lncRNA 可同時調控多個miRNA，同一個miRNA 可以同時受到多個lncRNA 的調控作用，細胞中各個基因也正是通過這種復雜的網絡最終影響細胞功能發揮[23]。本研究結果表明，GABPB1-IT1和miR-501存在互補結合位點，而且上調GABPB1-IT1后的宮頸癌細胞中miR-501表達水平下降，推測GABPB1-IT1 的作用機制可能與miR-501 有關。miR-501 是一個與人類腫瘤有關多功能小分子RNA，在肝癌、非小細胞肺癌、宮頸癌等腫瘤中表達上調，miR-501 能夠促進腫瘤細胞的生長和遷移[10,24-25]。本研究通過逆轉實驗驗證GABPB1-IT1的作用機制是否與miR-501 有關，結果表明，miR-501 mimics 提高了上調GABPB1-IT1后的宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲能能力，說明miR-501具有逆轉GABPB1-IT1 對宮頸癌細胞影響的作用，GABPB1-IT1通過miR-501參與宮頸癌進展。

總而言之，GABPB1-IT1 在宮頸癌中可能發揮抑制作用，上調GABPB1-IT1 表達降低宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力，機制與靶向下調miR-501 有關。本研究結果為分子靶向治療宮頸癌提供了參考資料，為研究GABPB1-IT1 在宮頸癌中的作用機制奠定了基礎，以后可進一步探討GABPB1-IT1 靶向miR-501的下游機制。