LncRNA DLX6-AS1調控miR-497/HMGA2對骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響*

林 浩，徐德利

（華中科技大學協和東西湖醫院 武漢市東西湖區人民醫院骨科，武漢 430040）

骨肉瘤是一種常見的惡性程度高的原發性惡性腫瘤，大多數患者在確診時已發生轉移，因此患者預后差[1]。目前雖然一些化療方案可提高骨肉瘤患者5 年生存率，但約一半的患者在術后或化療藥物治療后出現耐受，且存在較高的轉移復發風險。因此，尋找有效的骨肉瘤早期診療的方法尤為重要[2]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt的非編碼RNA，可通過表觀遺傳學、轉錄及轉錄后水平影響基因表達和翻譯，進而參與腫瘤生長。近年來研究發現，多種腫瘤中lncRNA 表達異常，其異常表達與腫瘤發生發展密切相關[3-4]。lncRNA 無遠端同源框6 反義1（DLX6-AS1）定位于7q21.3，目前在結腸癌、胃癌等多種腫瘤中有研究[5-6]。研究顯示，lncRNA DLX6-AS1 可通過調節miR-641/HOXA9促進骨肉瘤細胞增殖及轉移[7]。提示DLX6-AS1 可通過與微小RNA（miRNA）相互作用，miRNA又可調控下游靶蛋白從而影響骨肉瘤進展。miR-497是miRNA家族成員之一，在包括骨肉瘤在內的多種腫瘤中異常表達，影響腫瘤進展[8-9]。本研究旨在探討lncRNA DLX6-AS1 調控miR-497/高遷移率族蛋白A2（HMGA2）分子軸對骨肉瘤MG63 細胞增殖、凋亡的影響，為DLX6-AS1/miR-497/HMGA2 作為骨肉瘤患者潛在的診斷標志物和治療靶標提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 胎牛血清購自杭州四季青公司；達爾伯克改良伊格爾培養基（DMEM）購自美國Hyclone公司；脂質體2000、Trizol均購自美國Invitrogen 公司；PCR 試劑盒及逆轉錄試劑盒均購自日本TAKARA公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；細胞凋亡試劑盒、流式細胞儀均購自美國BD Biosciences 公司；RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度分析試劑盒、增強化學發光（ECL）試劑均購自中國碧云天公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；增殖細胞核抗原（PCNA）、caspase3抗體均購自英國Abcam；酶標儀購自美國Biotek 公司；PCR儀購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養 人骨肉瘤細胞MG63 購自美國ATCC。MG63細胞用添加10%胎牛血清及1%青－鏈霉素的DMEM培養基，在5%CO2、37 ℃培養箱中培養。取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞瞬時轉染與分組 構建DLX6-AS1 特異性小干擾RNA（siRNA）（si-DLX6-AS1）及陰性對照（si-NC）、DLX6-AS1過表達載體（pcDNA3.1-DLX6-AS1）及空載體（pcDNA3.1）、miR-497 mimics/inhibitor 及相應對照miR-NC/anti-miR-NC 和HMGA2 過表達載體（pcDNA3.1-HMGA2）。轉染前24 h，按1×104個/孔的細胞密度接種于6孔板，細胞融合度達到75%時進行細胞轉染。將MG63細胞分為control組（未轉染）、si-DLX6-AS1組（轉染si-DLX6-AS1）、si-NC 組（轉染si-NC）、pcDNA3.1-DLX6-AS1 組（轉染pcDNA3.1-DLX6-AS1）、pcDNA3.1 組（轉染pcDNA3.1）、miR-497 mimics組（轉染miR-497 mimics）、anti-miR-497 組（轉染miR-497 inhibitor）、miR-NC組（轉染miR-NC）、anti-miR-NC 組（轉染anti-miRNC）、si-DLX6-AS1+anti-miR-497 組（共轉染si-DLX6-AS1+miR-497 inhibitor）和si-DLX6-AS1+HMGA2 組（共轉染si-DLX6-AS1+pcDNA3.1-HMGA2）。細胞轉染按照脂質體2000 說明書進行操作。

1.4 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測DLX6-AS1、miR-497 和HMGA2 表達 Trizol 法提取細胞總RNA，NanoDrop檢測提取的RNA濃度及純度，逆轉錄為cDNA。按照PCR試劑盒說明設置反應體系為20 μL，其中逆轉錄產物2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、10 μL SYBR Green Mix。反應條件為95 ℃5 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 個循環。引物序列如下：DLX6-AS1 上游：5’-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3’，下游：5’-ATTGACATGTTAGTGCCCTT-3’；HMGA2 上游：5’-GCCAAGAGGCAGACCTAGGAAA-3’，下游：5’-CATGGCAATACAGAATAAGTGGTCA-3’；GAPDH 上 游：5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’，下游：5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’；miR-497上游：5’-ACCAGCAGCACACTGTGGTTTGT-3’；下游：5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’；U6上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-△△Ct法計算DLX6-AS1、miR-497和HMGA2表達。

1.5 CCK-8 法檢測細胞增殖 按照5 000 個/孔均勻接種各組細胞于含有完全培養基的96孔板中，每孔100 μL，每組設置5個復孔。分別在培養24 h、48 h和72 h，每孔加入5 mg/mL的CCK8溶液10 μL，在培養箱中常規孵育2 h，用酶標儀檢測490 nm 波長處各孔光密度（OD）值。OD值越大，細胞增殖能力越強。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 胰酶消化轉染后的細胞，調整細胞濃度為5×105個/mL。取細胞懸液1 mL，離心、洗滌。在每孔中加入5 μL Annexin V/FITC，避光室溫放置15 min。檢測前加入5 μL碘化丙錠（PI），流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.7 雙熒光素酶報告實驗檢測熒光素酶活性 在線生物信息學軟件顯示DLX6-AS1 和HMGA2 與miR-497均存在結合位點。為了驗證它們之間的靶向關系，通過PCR 擴增DLX6-AS1-野生型（WT）和HMGA2-WT 序列，通過定點誘變系統構建DLX6-AS1-突變型（MUT）及和HMGA2-MUT的3’UTR載體，并將其克隆到pmirGLO 熒光素酶載體中，分別合成DLX6-AS1-WT、HMGA2-WT、DLX6-AS1-MUT 和HMGA2-MUT 熒光素酶載體，并與miR-497 mimics共轉染至MG63細胞，轉染48 h，通過雙熒光素酶報告基因測定試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.8 Western blotting 法檢測PCNA 和cleaved caspase3 表達 提取細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE 分離蛋白，轉移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗稀釋液（PCNA、cleaved caspase3 及內參GAPDH 稀釋倍數均為1∶1 000），4 ℃冰箱搖床孵育過夜；洗膜3 次，HRP 標記的二抗（稀釋倍數為1∶5 000）室溫孵育1 h。ECL 顯色、曝光，凝膠圖像處理系統掃描條帶，Image J軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.9 統計學方法 所有數據采用SPSS 21.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抑制DLX6-AS1 表達對MG63 細胞增殖、凋亡的影響 與control 組比較，si-DLX6-AS1 組DLX6-AS1 表達和細胞增殖能力降低，凋亡率升高（P＜0.05）；control組和si-NC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1、表1。

表1 轉染DLX6-AS1 siRNA后的細胞活性 ，n=3

表1 轉染DLX6-AS1 siRNA后的細胞活性 ，n=3

與control組比較，*P＜0.05。

圖1 MG63細胞轉染DLX6-AS1 siRNA后DLX6-AS1表達及凋亡情況

2.2 DLX6-AS1 和miR-497 靶向關系驗證 靶基因預測軟件顯示DLX6-AS1和miR-497有可結合的位點。通過雙熒光素酶報告基因驗證其靶向關系，結果顯示：與miR-NC組比較，miR-497 mimics組共轉染miR-497 mimics和DLX6-AS1-WT 的MG63 細胞熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而miR-497 mimics 與DLX6-AS1-MUT 共轉染后，熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。進一步采用qPCR 檢測抑制或過表達DLX6-AS1后的細胞中miR-497表達情況，結果顯示：抑制DLX6-AS1（si-DLX6-AS1組）可明顯促進miR-497 表達，而過表達DLX6-AS1（pcDNA3.1-DLX6-AS1 組）可明顯降低miR-497 表達（P＜0.05），見圖2。說明miR-497 是DLX6-AS1的靶基因，DLX6-AS1可負調控miR-497。

圖2 DLX6-AS1靶向調控miR-497

2.3 miR-197和HMGA2靶向關系的驗證 生物信息學數據庫發現HMGA2可能是miR-197的候選靶基因。進一步通過雙熒光素酶報告基因驗證兩者關系，結果顯示：與miR-NC組比較，miR-497 mimics組熒光素酶活性降低（P＜0.05），而將其與靶向位點發生突變的HMGA2-MUT 共轉染MG63 細胞后，miR-497 對熒光素酶活性抑制作用消失。qPCR 結果顯示：miR-497 mimics組HMGA2表達明顯降低，anti-miR-497 組HMGA2 表達明顯升高（P＜0.05），見圖3。說明HMGA2 是miR-497 的靶基因，miR-497可負調控HMGA2表達。

圖3 miR-197靶向調控HMGA2

2.4 抑制DLX6-AS1表達調節miR-497/HMGA2分子軸影響MG63細胞增殖和凋亡 為了證實DLX6-AS1 是否可通過下調miR-497 并上調HMGA2 影響MG63 細胞增殖和凋亡，將si-DLX6-AS1 和antimiR-497 及HMGA2 過表達載體分別轉染MG63 細胞，qPCR 結果顯示：與si-NC 組比較，si-DLX6-AS1組HMGA2 表達和細胞增殖能力降低，凋亡率升高（P＜0.05）；與si-DLX6-AS1 組比較，si-DLX6-AS1+anti-miR-497 組 和si-DLX6-AS1+HMGA2 組HMGA2 表達和細胞增殖能力升高，凋亡率降低（P＜0.05），見圖4、表2。

表2 DLX6-AS1通過miR-497/HMGA2分子軸對MG63細胞增殖的影響

圖4 DLX6-AS1通過miR-497/HMGA2分子軸對MG63細胞凋亡的影響

2.5 抑制DLX6-AS1通過調節miR-497/HMGA2分子軸影響MG63細胞PCNA、cleaved caspase3表達 通過Western blotting 檢測各組細胞PCNA 和cleaved caspase3 表達，結果顯示：與si-NC 組比較，si-DLX6-AS1 組PCNA 表達降低，cleaved caspase3表達升高（P＜0.05）；與si-DLX6-AS1 組比較，si-DLX6-AS1+anti-miR-497 組和si-DLX6-AS1+HMGA2 組PCNA 表達升高，cleaved caspase3 表達降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 DLX6-AS1通過miR-497/HMGA2分子軸對MG63細胞PCNA、cleaved caspase3表達的影響

3 討論

越來越多的研究表明，lncRNAs 是表現出最大多樣性的功能性ncRNAs，在等位基因表達、胚胎形成、蛋白編碼基因調節、細胞分化、凋亡、生長、干細胞多功能性等中發揮重要作用[10]。多項研究表明，在腫瘤形成階段，lncRNAs存在異常表達，其異常表達可促進腫瘤進展[11]。已有研究發現lncRNA HOX轉錄反義RNA（HOTAIR）、lncRNA FOXD2-AS1、lncRNA叉頭蛋白F1-反義RNA1（FOXF1-AS1）等與骨肉瘤發生發展有關，但其對骨肉瘤發生機制研究尚未明確[12-14]。DLX6-AS1在腫瘤中研究較少，有研究發現DLX6-AS1 可影響骨肉瘤細胞增殖轉移，但其對骨肉瘤細胞凋亡及機制影響尚未明確[7]。因此，本研究將DLX6-AS1 特異性siRNA 轉染骨肉瘤MG63細胞，發現細胞增殖能力明顯降低，凋亡率升高。提示抑制DLX6-AS1可誘導骨肉瘤細胞凋亡。

miR-497 屬于miR-15 家族成員之一，在胃癌、喉鱗癌等多種腫瘤中均有表達[15-16]。在上述腫瘤中常發生miR-497的缺失、甲基化或組蛋白修飾，引起miR-497 表達降低，進而部分或全部喪失其調節靶基因作用，從而導致腫瘤發生發展。因此，對抗miR-497失活，靶向其下游靶基因，或有活性的miR-497 mimics，有望成為腫瘤治療的一個新的領域。有研究顯示，miR-497 可在體內體外抑制骨肉瘤細胞生長[17]；lncRNA PVT1 可通過調控miR-497/HK2分子軸促進糖酵解及骨肉瘤進展[18]。高遷移率族蛋白（HMG）分子量小于30 ku，是細胞核內一組非組蛋白染色體蛋白，HMGA 作為其中一種亞型，在高等生物細胞增殖分化、生長發育及包括腫瘤在內的多種疾病中發揮重要作用[19]。人類HMGA 家族有HMGA1 和HMGA2 兩個成員。多種腫瘤中可發現HMGA2 的重排現象，其過表達與腫瘤生長密切相關。如Yang 等[20]研究顯示，膀胱癌中HMGA2 高表達，其表達與患者臨床病理特征與預后有關；曲珊珊等[21]研究顯示，在骨肉瘤細胞中抑制HMGA2 表達可降低細胞增殖和轉移能力，誘導細胞凋亡，上調caspase3和caspase9表達；He等[22]研究顯示，miR-106a-5p可靶向HMGA2抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲和遷移。本研究通過雙熒光素酶活性檢測發現miR-497和DLX6-AS1與HMGA2均存在靶向關系，且抑制DLX6-AS1 表達可促進miR-497 表達，降低HMGA2表達，過表達DLX6-AS1可抑制miR-497表達；細胞轉染miR-497 mimics后HMGA2表達降低，轉染miR-497 inhibitor 后HMGA2 表達升高，提示DLX6-AS1 可負調控miR-497/HMGA2 分子軸。進一步將DLX6-AS1 siRNA 和miR-497 inhibitor 及HMGA2 過表達載體轉染MG63 細胞，發現抑制miR-497 及過表達HMGA2 均可減弱DLX6-AS1 siRNA 對MG63 細胞的增殖抑制及凋亡促進作用（P＜0.05）。

PCNA 是在DNA 合成期階段一個必不可少的因子，其表達水平可反映細胞的增殖能力，目前在腫瘤研究中已將其作為細胞增殖活性檢測指標[23]。Caspase3是caspase家族關鍵酶，其活化對腫瘤細胞凋亡有明顯的誘導作用[24]。本研究結果顯示，抑制DLX6-AS1 可明顯下調PCNA 表達，上調cleaved caspase3表達，而抑制miR-497及過表達HMGA2均可減弱si-DLX6-AS1 對MG63細胞PCNA 和cleaved caspase3 表達的影響（P＜0.05）。說明抑制DLX6-AS1 表達可通過負調控miR-497/HMGA2 分子軸下調MG63細胞中PCNA和caspase3的表達。

綜上所述，抑制骨肉瘤MG63 細胞DLX6-AS1表達可降低細胞增殖能力，促進細胞凋亡，其機制可能與上調miR-497 并下調HMGA2 有關。LncRNA DLX6-AS1 發揮促癌作用，有望成為骨肉瘤治療新靶點。