廣西地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌熱點(diǎn)基因突變譜分析*

王守峰，吳俊偉，蘇劉福，葉甲舟

（廣西壯族自治區(qū)腫瘤醫(yī)院，南寧 530021）

食管癌（sophageal cancer，EC）在全球所有類型的癌癥中的發(fā)病率為第7 位，患者的存活率低。在中國，食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占EC 患者的95%以上。由于對(duì)于ESCC 的早期檢測(cè)沒有敏感的方法，所以被診斷時(shí)，大部分EC患者已經(jīng)處于疾病晚期，且這些患者在診斷時(shí)有超過一半發(fā)生了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)于早期ESCC的預(yù)測(cè)和治療非常重要[1]。然而，目前暫無有效的治療方法，放、化療是唯一的治療選擇。腫瘤靶向藥物是近年來治療的主要趨勢(shì)，通過選擇性作用突變蛋白或基因，有針對(duì)性地抑制癌細(xì)胞，幾乎不影響正常細(xì)胞，具有“高效低毒”的特點(diǎn)。然而，靶向藥的應(yīng)用前提需要明確患者具體突變類型，以判斷患者能否從中獲益。同時(shí)，由于缺少腫瘤中基因突變的具體信息，針對(duì)某類腫瘤藥物的靶向藥物開發(fā)也會(huì)陷入困擾[2]。高通量測(cè)序能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因多位點(diǎn)突變，融合基因，基因拷貝數(shù)變化，基因缺失/擴(kuò)增等功能，已逐漸被運(yùn)用在指導(dǎo)晚期癌癥的用藥中[3]。研究表明，針對(duì)患者具體的靶點(diǎn)選擇合適的新輔助化療手段，已被證明可提高對(duì)卵巢癌[4]、HER2 陽性乳腺癌[5]等的治療效果。本研究將利用高通量測(cè)序分析ESCC樣本的熱點(diǎn)基因突變情況，分析主要突變位點(diǎn)、突變類型和頻率，為尋找ESCC 的生物標(biāo)志物以及潛在藥物作用靶標(biāo)提供基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2020年1～12月就診于廣西壯族自治區(qū)腫瘤醫(yī)院的65例ESCC患者的腫瘤組織，其中女24 例，男41 例，年齡30～75 歲，平均（55.26±8.6）歲，且排除其它腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 DNA 的提取和文庫的準(zhǔn)備 使用QIAamp DNA 的FFPE 組織試劑盒（德國Qiagen,Hilden）提取DNA。使用Qubitds DNA HS 檢測(cè)試劑盒和Qubit 3.0 測(cè)度計(jì)(Life Technologies,Eugene,Oregon,USA)定量DNA。按照Illumina 標(biāo)準(zhǔn)庫建設(shè)說明構(gòu)建順序庫（Illumina，Inc，美國加利福尼亞州）。根據(jù)制造商提供的方法，文庫構(gòu)建的最佳DNA 為20 ng（1.67 ng/μL），最小DNA為5 ng（0.41 ng/μL）。每個(gè)文庫都使用KAPA SYBR?FAST 通用qPCR 工具包進(jìn)行量化。

1.3 樣本分析將樣本送至至本醫(yī)療科技公司進(jìn)行溯系列分析（Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)），根據(jù)操作流程進(jìn)行超深度測(cè)序（平均測(cè)序深度大于500×），共檢測(cè)638 個(gè)癌癥相關(guān)基因的全部外顯子，63 個(gè)基因的部分內(nèi)含子，鑒定不同類型的基因變異，如單核苷酸變異、插入或缺失、拷貝數(shù)變異和重排。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0 與SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC患者不同年齡段人數(shù)統(tǒng)計(jì) 通過統(tǒng)計(jì)患者年齡、性別和發(fā)病率，本研究其中男患者分布：30～39歲，3例；40～49歲，5例；50～59歲，20例；60～69歲，11 例；70-75 歲，2 例。女患者：30～39 歲，1 例；40～49歲，3例；50～59歲，12例；60～69歲，7例；70～75歲，1 例?；颊吣挲g主要集中于50～69 歲，男患者與女患者在此年齡段的比例分別為75.61%和79.17%。

2.2 ESCC高頻突變基因 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)突變率（圖1），突變率排名前10 的基因分別為TP53（90.77%）、CCND1（53.85%）、FGF19（52.31%）、FGF3（50.77%）、FGF4（50.77%）、CDKN2A（32.31%）、KMT2D（21.54%）、NOTCH1（21.54%）、TP63(20%)、ZNF750（18.46%）、LRP1B（18.46%）。

圖1 ESCC中突變率前10的基因及各自的突變率

2.3 不同類型的突變?cè)?5例中的分布情況 從本研究的65 個(gè)患者基因突變類型（alternation type）分析中可以得出，92.31%（60/65）發(fā)生了拷貝數(shù)改變（copy number change）。而這60 個(gè)發(fā)生拷貝數(shù)改變（copy number change）的人中，絕大多數(shù)，即93.33%（59/60）發(fā)生了基因擴(kuò)增（gene amplification），23.33%（14/60）發(fā)生了基因缺失（gene deletion），且以上同時(shí)發(fā)生了基因擴(kuò)增和缺失的占23.33%（14/60）。

65例患者都發(fā)生了短變體(short variants)，且都伴隨著替換(substitution)。53.85%（35/65）發(fā)生在chr17（17 號(hào)染色體），其次為chr2，52.31%（34/65），chr1，chr9，chr12，chr8，chr3，chr4，chr19 和chr11 的突變率也呈現(xiàn)較為集中的分布。這65例中，83.08%(54/65)發(fā)生了截?cái)嗤蛔?truncation)，也以chr17上最多，占57.41%(31/54)，但是具體突變的點(diǎn)分布均勻，未見集中改變的堿基位點(diǎn)。除了這2類主要的突變類型，38.46%(25/65)發(fā)生了較長片段的插入與缺失（indel，insertion 和deletion 的簡(jiǎn)稱）；30.77%(20/65)發(fā)生了重新排列（rearrangement），見圖2～圖4。

圖2 基因突變類型及在樣本中的突變分布

圖3 發(fā)生拷貝數(shù)變異的細(xì)分類型及分布

圖4 ESCC患者不同染色體基因突變分布

2.4 高頻突變基因的主要突變類型和位點(diǎn) TP53的突變與多種癌癥有關(guān)。針對(duì)TP53 突變的患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，59 例發(fā)生了該突變的患者中，突變類型（alternation type）皆為短變體(short variants)，主要為截?cái)嗤蛔?truncation)（44.07%，26/59）和替換(substitution)（45.76%，27/59），皆位于chr17 染色體。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這27個(gè)替換樣本中，40.74%（11/27）發(fā)生基因組DNA 變化?；蚪MDNA 中，堿基被替換成A 是主要變化，而Coding DNA 中的堿基替換成T是主要變化，見表1。

表1 TP53突變位點(diǎn)信息

針對(duì)CCND1 的突變進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，35 個(gè)CCND1突變的患者中，其主要是突變類型為拷貝數(shù)變化，97.14%（34/35）的該突變的患者發(fā)生基因擴(kuò)增，無突變位點(diǎn)信息。針對(duì)FGF3 突變類型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)96.76%（32/33）發(fā)生了拷貝數(shù)改變（基因擴(kuò)增）。同樣分析FGF19，97.06%（33/34）發(fā)生了拷貝數(shù)改變（基因擴(kuò)增），F(xiàn)GF4 突變中94.76%（32/33）發(fā)生了拷貝數(shù)改變（基因擴(kuò)增）。分析CDK2A突變發(fā)現(xiàn)，其主要發(fā)生了拷貝數(shù)改變（基因擴(kuò)增），無具體突變位點(diǎn)。

CDKN2A的突變位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，該位點(diǎn)的突變位于chr9 上（表2），突變位點(diǎn)無聚集性。KMT2D 的突變位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，其主要為G/C堿基被替換（表3）。NOTCH1突變信息顯示其主要突變?yōu)镚/C堿基被替換成A/T（表4）。ZNF750突變信息無集中突變類型和位點(diǎn)（表4），LRP1B 突變信息顯示主要突變?yōu)镚/C堿基被替換成A/T（表5）。

表2 CDKN2A突變位點(diǎn)

表3 KMT2D突變信息

表4 NOTCH1突變信息

表5 ZNF750突變信息

2.5 ESCC 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將前10 個(gè)高突變基因進(jìn)行STRING分析，結(jié)果顯示TP53，NOTCH1，CCND1之間存在關(guān)聯(lián)。其中NOTCH1和TP63為表皮細(xì)胞調(diào)控的關(guān)鍵蛋白（紅球），NOTCH1 和FGF4（藍(lán)球）是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白。表明ESCC的發(fā)生與NOTCH1/TP63或NOTCH1/FGF4通路相關(guān)。見圖5。

圖5 STRING分析結(jié)果

表6 LRP1B突變信息

3 討論

EC在全世界的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，且與地理位置及飲食習(xí)慣有關(guān)，我國46%的EC 死亡可歸因于吸煙和酒精攝入，且男女患者的比例接近[6]。近年來，ESCC 的治療效果一直不盡人意，主要原因與診斷較晚，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療耐藥，腫瘤異質(zhì)性和復(fù)發(fā)有關(guān)。目前ESCC缺乏高效的靶向治療藥物[7]，派姆單抗和尼魯單抗（pembrolizumab and nivolumab）現(xiàn)在已被批準(zhǔn)用于食管鱗癌，但需要更多的數(shù)據(jù)來了解這些藥物如何在非轉(zhuǎn)移性環(huán)境中使用。由于整體預(yù)后不佳，仍需要新的治療方法[8]。現(xiàn)有的方法包括癌癥疫苗和免疫檢查點(diǎn)抑制劑[9]，以及以NRF2 等信號(hào)通路為靶標(biāo)的藥物治療[10]，放射治療等[11]。但由于地域不同，基因的突變類型往往也存在差異，傳統(tǒng)的候選基因法建立在假說之上，需要進(jìn)行功能驗(yàn)證，且通量低，無法鑒定出未知的變異位點(diǎn)，因此需要更加全面、高通量的測(cè)序方法選擇靶點(diǎn)。

隨著第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于EC 基因?qū)用娴难芯恳搽S之深入[12]。其中，Salem 等[13]揭示了225例中國河北地區(qū)患者的ESCC突變情況，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)ESCC 患者中最常見的突變基因是TP53（96%）、CCND1（46%）、FGF4（44%）、FGF19（44%）、FGF3（44%）、CDKN2A（31%）、PIK3CA（26%）、NOTCH1（24%）、KMT2D（18%）、FAT1（16%）和LRP1B（16%），F(xiàn)GFR1 在ESCC 中擴(kuò)增明顯更多。并揭示了中國ESCC 患者的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。臨床靶基因分析表明，近一半的中國ESCC 患者可能會(huì)受益于基因特異性靶標(biāo)藥物的治療[14]。而Song 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，廣東省潮汕地區(qū)ESCC 患者中TP53、RB1、CDKN2A、PIK3CA、NOTCH1 和NFE2L2 為突變率最高的基因。因此，分析不同地區(qū)ESCC 的基因突變差異，并進(jìn)一步闡明ESCC 的分子機(jī)制，對(duì)于制定更好的預(yù)防和治療策略是非常有必要的。

分析以上研究不難發(fā)現(xiàn)，腫瘤蛋白p53（TP53）是ESCC 中最常見的突變基因。TP53 突變與高危疾病，對(duì)常規(guī)化療的耐藥性和預(yù)后不良有關(guān)[16]。p53在ESCC的診斷和治療中都是一個(gè)有價(jià)值的分子靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，ESCC發(fā)生的突變類型中TP53突變率最高，表明其在ESCC 的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用。這與Gao 等[17]的研究結(jié)果一致，即EC 中，TP53 突變占主導(dǎo)，約為93%，其次為CCND1，占33%、CDKN2A 占20%。Kamata 等[18]用不同TP53突變的ESCC細(xì)胞株和兩種p53靶向藥物進(jìn)行了細(xì)胞活力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞株的生長抑制存在差異。提示腫瘤對(duì)化合物的響應(yīng)可能取決于TP53 突變類型，但仍有必要進(jìn)一步研究TP53與其他基因的相互作用，以確定其作為治療靶點(diǎn)的有效性。

NOTCH是指編碼哺乳動(dòng)物細(xì)胞中跨膜受體家族的一組基因，參與胚胎發(fā)育和正常細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)、凋亡和分化。NOTCH1是Notch家族的成員，與許多與腫瘤發(fā)生有關(guān)的信號(hào)通路緊密相連。在嚙齒動(dòng)物和人類的正常食道中，NOTCH1 高度表達(dá)，在正常生理狀態(tài)下，NOTCH 通路調(diào)控食管鱗狀上皮的發(fā)育，特別是鱗狀分化，對(duì)于維持鱗狀上皮的完整性是必不可少的[19]。暴露于外在和內(nèi)在因素，如胃食管反流、飲酒和炎癥，都會(huì)下調(diào)NOTCH 通路，從而抑制食管鱗狀上皮細(xì)胞的鱗狀分化。在ESCC中，NOTCH信號(hào)通路具有抑癌和致癌的雙重作用?？梢酝ㄟ^多種方法來實(shí)現(xiàn)NOTCH1抑制，其中最常見的方法是產(chǎn)生泛NOTCH抑制作用的分泌酶抑制劑DAPT(GSI-IX)，或者使用產(chǎn)生更特異的阻斷作用的NOTCH1短干擾RNA或NOTCH1單克隆抗體。NOTCH1的下調(diào)可以單獨(dú)使用，也可以與化學(xué)療法聯(lián)合使用，從而達(dá)到協(xié)同作用并降低耐藥發(fā)生[20]。最近，Alvarez-Trotta 等[21]發(fā)現(xiàn)了一種小分子抑制劑NADI-351，能夠選擇性地破壞EC 細(xì)胞中NOTCH1轉(zhuǎn)錄，在小鼠模型中表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤活性，且不會(huì)引起腸道毒性。這為今后的研究提供了一定的參考。

本研究通過蛋白之間相互作用預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，NOTCH 突變可能和TP53 存在一定聯(lián)系。研究表明，突變、缺失和擴(kuò)增改變了TP53、NOTCH1、CDKN2A和CCND1等基因的正常功能，是促進(jìn)食管黏膜上皮細(xì)胞向ESCC 轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵變化，這與本研究非常接近。Zhang等[14]研究中，河北地區(qū)ESCC患者的TP53、CCND1、FGF4、FGF19、FGF3、CDKN2A、NOTCH1、KMT2D 和LRP1B（排前10 的突變）也是較高的突變。不同的是，他們的研究中PIK3CA 和FAT1的突變率較高，而本研究中ZNF750和TP63相對(duì)較高，而Song 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，廣東省潮汕地區(qū)ESCC患者中TP53、RB1、CDKN2A、PIK3CA、NOTCH1和NFE2L2（排名從高到低）為突變率最高的基因。表明不同區(qū)域ESCC 突變存在共性與差異。

對(duì)于NOTCH1 相關(guān)通路的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其在ESCC發(fā)生發(fā)展的過程中存在重要作用。正如Jia等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，GASC1/NOTCH1 信號(hào)通路可能是治療ESCC 患者的潛在治療靶點(diǎn)。研究表明，NOTCH1 能夠通過促進(jìn)上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來加速三陰性乳腺癌，抑制NOTCH1-ATR-CHK1 級(jí)聯(lián)與順鉑協(xié)同殺傷TNBC，為這種致命疾病提供了有效的臨床選擇[23]?；诖耍覀兛梢赃M(jìn)一步研究其在ESCC的作用。

之前的研究已經(jīng)提出了FGF19、FGF4、FGF3和CCND1在各種癌癥中的重要作用[13,24-25]。在染色體不穩(wěn)定的情況下發(fā)生的熔斷橋循環(huán)擴(kuò)增了CCND1[26]。CCND1 通常與其鄰近的致癌基因CTTN 共同擴(kuò)增，其產(chǎn)物促進(jìn)ESCC 細(xì)胞的遷移[27]。此外，ESCC中的FGFR1、MYC、EGFR、KRAS、MDM2、TP63 和PRKC、SOX2 和PIK3CA、NKX2-1也都已被證實(shí)是ESCC 的驅(qū)動(dòng)因素[1]。與之前的研究類似，本研究也觀察到CCND1、FGF19、FGF3 和FGF4 的頻繁擴(kuò)增，這支持了ESCC 患者染色體11q13 不穩(wěn)定的發(fā)生。EC 的發(fā)病機(jī)制涉及一個(gè)由多個(gè)因素和基因突變積累組成的級(jí)聯(lián)過程。在其它研究中，與ESCC 相關(guān)高頻突變基因的還包括PTEN、TOP2A、PIK3CA、XRCC1等[28]。

綜上，本研究通過高通量測(cè)序展示了廣西地區(qū)ESCC 高頻突變基因和位點(diǎn)，提示不同區(qū)域之間高頻突變基因存在差異，且我們預(yù)測(cè)NOTCH1 在ESCC 的發(fā)生過程中起到重要作用，可以作為進(jìn)一步研究的方向。此外，本研究結(jié)果為基于廣西地區(qū)ESCC的防治提供指導(dǎo)基礎(chǔ)。