右美托咪定對腸源性膿毒癥大鼠腸屏障功能保護及抗凋亡作用的機制研究*

徐 穎，馬四清

（青海省人民醫院重癥醫學科，西寧 810007）

膿毒癥是一種因患者全身出現的惡性炎癥反應狀態，主要由于各種感染、創傷、外科手術等反復刺激導致機體產生大量炎性因子。膿毒癥患者的病情多變且不穩定，膿毒癥后腸腔內的細菌和大量釋放的內毒素可以激活腸道免疫細胞，釋放出多種炎癥介質導致腸粘膜損傷，隨著病情的進一步發展可能會出現多器官功能衰竭[1-2]。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是目前比較常用的一種新興的鎮靜鎮痛藥，主要應用于術后鎮痛、麻醉等[3-4]。既往研究顯示，DEX還具有抗炎癥、抗凋亡的作用，可以減輕膿毒癥患者的炎癥性損傷[5]，但目前關于DEX 在保護膿毒癥患者腸道功能中的作用機制尚不明確。本研究擬復制大鼠膿毒癥模型，探討DEX保護膿毒癥大鼠腸屏障功能，抗腸道細胞凋亡的作用機制，為進一步使用DEX治療膿毒癥提供實驗和理論依據，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源 SPF 級SD 大鼠60 只，購自廣東醫學院實驗動物中心，粵監證字2004A029 號，所有大鼠均在本院動物中心實驗室飼養，飼養溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%，該實驗經過動物倫理委員會批準同意。

1.2 藥物與試劑 鹽酸DEX 注射液（國藥準字：H20 090248；生產廠家：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）購自武漢大學人民醫院；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；Caspase-3 抗體（批號：31A1067201806）購自碧云天公司；Bcl-2 抗體（貨號：sc-7382；批號：20190201）、Bax抗體（貨號：sc-7480；批號：20190301）購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；HRP 羊抗兔IgG、HRP 羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo 公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）及D-乳酸測定試劑購自美國Sigma公司。

1.3 儀器 722分光光度計購自上海第三分析儀器制造廠；全自動脫水機購自湖北孝感醫用電子技術有限公司；病理切片機購自德國Leica公司；BS-124s型電子天平購自北京賽多斯儀器系統有限公司；3-5w低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡購自上海光學儀器廠；蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad 公司；凝膠成像系統購于以色列DNR公司；LD-66實驗室切片機購自長沙益廣制藥機械公司。

1.4 分組及建立模型 將60 只大鼠適應性喂養1周，按隨機數字表法將大鼠分為空白對照組（Control）、模型組（Model）、低劑量DEX組（5 μg/kg）和高劑量DEX 組（10 μg/kg），每組15 只；除空白對照組外，其余45 只大鼠制備膿毒癥模型，制作方法及判斷模型是否成功參考付曉菲等[6]研究。具體操作：使用10%的水合氯醛麻醉，采用盲腸結扎穿孔術，導致大鼠形成膿毒癥，臍上沿中線開腹1～2 cm 使得大腸暴露，結扎距盲端約2 cm，使用針在結扎腸斷貫穿3 次，并擠出腸溶物后將盲腸收回。空白對照組僅僅開腸暴露盲腸后收回，消毒、縫合。

1.5 藥物干預 制作完大鼠膿毒癥模型1 h后通過尾靜脈注射DEX，低劑量DEX 組注射速率為5 μg/kg·h-1，分別在術后1 h和術后6 h注射兩次，1 h/次，注射總量為1 mL；高劑量DEX組注射速率為10 μg/kg·h-1，分別在術后1 h和術后6 h注射兩次，1 h/次；模型組和空白對照組注射等量的生理鹽水。

1.6 蘇木精—伊紅（HE）染色觀察大鼠腸組織病理學改變 藥物處理24 h 后，放血處死大鼠，取大鼠血液，保存于-80 ℃冰箱中國以供后期使用；取大鼠距回盲瓣5 cm處取大鼠小腸組織約0.5～1 cm，生理鹽水洗凈，10%的多聚甲醛固定45 h，然后使用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。HE染色，在10×20的光鏡下觀察大鼠腸組織病理學改變。

1.7 分光光度法檢測DAO、D-乳酸 使用分光光度法檢測DAO、D-乳酸含量水平，取大鼠血液標本，在4 ℃條件下，以3 000 r/min 的轉速離心5 min，使用分光光度法測定血清中DAO活性，測定紫外波長為436 nm處的吸光值（OD），以DAO標準液不同濃度測出的值為X軸，相對OD值為Y坐標，做曲線得出回歸方程，算出大鼠血液標本中DAO 含量水平；計算D-乳酸含量水平時分光光度計測定340 nm 處的OD值，以D-乳酸標準液不同濃度值為X軸，相對應的OD值為Y作標準曲線，得出回歸方程，計算出大鼠血液標本中D-乳酸含量水平。

1.8 ELISA 法檢測 取大鼠血液標本在4 ℃條件下，以3 000 r/min的轉速離心5 min，嚴格按照TNFα及IL-6試劑盒子上的操作方法，檢測其含量水平。

1.9 Western blotting 檢測蛋白表達水平 使用Western blotting檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平，取大鼠腸組織，使用剪刀剪碎后使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉移到PVDF 膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后加入各需要檢測蛋白的一抗（1∶1 000），二抗（1∶5 000），孵育2 h，以β-actin 為內參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.10 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，多組均數比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，偏態分布計量資料以中位數（四分位數）［M（P25～P75）］表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腸組織病理學觀察結果 空白對照組大鼠小腸組織結構完成，無水腫，絨毛形態正常；模型組小腸組織混亂，出現間質水腫，絨毛排列紊亂，上皮細胞脫落，有大量的中性粒細胞浸潤；使用DEX處理后的兩組水腫明顯的到改善，有少量上皮細胞脫落，小腸絨毛排列也較為整齊，見圖1。

圖1 大鼠腸組織病理學觀察結果（×200）

2.2 大鼠DAO及D-乳酸檢測結果 與空白對照組比較，模型組大鼠DAO 活性及D-乳酸水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，低劑量DEX 組大鼠DAO 活性及D-乳酸水平顯著降低（P＜0.01）；與低劑量DEX組相比，高劑量DEX組大鼠DAO 活性及D-乳酸水平著降低（P＜0.01），見圖2。

圖2 大鼠DAO及D-乳酸檢測結果

2.3 大鼠血清炎癥因子檢測結果 與空白對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α和IL-6水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量DEX 組大鼠TNF-α 和IL-6 水平顯著降低（P＜0.01）；與低劑量DEX 組比較，高劑量DEX 組大鼠TNF-α 和IL-6 水平為顯著降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 大鼠血清炎癥因子檢測結果

2.4 大鼠凋亡蛋白檢測結果 與空白對照組比較，模型組大鼠腸組織Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01），Bax 及Caspase-3 蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，低劑量DEX組大鼠腸組織Bcl-2 蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.01），Bax 及Caspase-3 蛋白相對表達量和顯著降低（P＜0.01）；與低劑量DEX 組相比，高劑量DEX 組大鼠Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.01），Caspase-3蛋白相對表達量水平顯著降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 大鼠凋亡蛋白檢測結果

與空白對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01；與低劑量DEX組比較，&&P＜0.01；A：大鼠血清TNF-α含量水平；B：大鼠血清IL-6含量水平。

3 討論

膿毒癥發病初期會伴隨著腸黏膜病理形態學變化，發生膿毒癥腸道上皮細胞會發生凋亡并脫落，間質會出現水腫同時腸道絨毛也會出現排列紊亂，腸道黏膜通透性也會發生一定的改變[7]。本研究發現，與模型組相比，使用DEX 組大鼠水腫明顯得到改善，有少量上皮細胞脫落，小腸絨毛排列也較為整齊。說明DEX可以有效患者小腸的損傷，同時抑制腸道上皮細胞的凋亡和脫落，改善膿毒癥大鼠腸道功能。李曠怡等[8]研究表明，抑制膿毒癥大鼠腸道黏膜凋亡可以有效緩解膿毒癥癥狀，與本研究得出的結論相一致。

DAO 主要存在于類和哺乳動物小腸絨毛上皮細胞中，可以參與絨毛上皮細胞內核酸與蛋白質的生成，并維持細胞內Ca2+的濃度平衡減少氧化應激損傷[9]。當腸道功能受到損傷后原本存在于腸道上皮細胞中的DAO 會隨著上皮細胞凋亡和脫落進入腸道，使得腸腔內的DAO活性上升，腸黏膜的DAO活性降低，使得腸黏膜的通透性改變。故DAO的含量可以反應腸道損傷的嚴重程度，其含量水平越高說明腸道損傷越重[10]。D-乳酸含量水平也是衡量腸道功能的重要指標之一[11]。人和動物機體本身不能產生D-乳酸，D-乳酸是腸道內細菌進行無氧酵解后的產物，當腸道功能受損后腸道內病原微生物大量生長繁殖，使得D-乳酸含量水平增加。故D-乳酸含量水平越高，說明腸道內病原微生物越多，血清內D-乳酸含量水平越高說明腸道黏膜通透性改變越大，腸黏膜功能受損越嚴重。本研究發現，與模型組相比，使用DEX 處理各組大鼠DAO 活性及D-乳酸含量水平顯著降低，說明DEX可以有效改善腸道黏膜的通透性，并有效降低腸道內的病原微生物越多，緩解腸道的損傷。鄭君剛等[12]研究顯示，DEX可以發揮鎮靜作用，抑制膿毒癥患者的應激反應失控，減輕炎癥反應，保護膿毒癥患者的腸屏障功能，提示DEX可能通過發揮鎮靜抗炎作用，緩解膿毒癥大鼠腸道組織損傷，但其具體的機制有待于進一步深入探索。

膿毒癥的發病機制較為復雜，目前多數觀點認為膿毒癥主要是由于感染導致身性炎癥反應，過多的炎癥介質會導致器官損傷，致使多器官衰竭死亡[13]。因此，控制炎癥反應是治療膿毒癥的關鍵因素之一。目前常見的炎癥因子包括TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等[14]。TNF-α 可以引起機體產生代謝性應激反應，并導致代謝產物含量增多使得局部炎性介質大量合成[15]。同時，IL-6 也有促進組織中基質金屬蛋白酶家族蛋白、前列腺素等炎癥物質產生和表達的作用，從而加速炎性反應進程。本研究發現與模型組相比，使用DEX 組大鼠DAO 活性及D-乳酸含量水平顯著降低，說明DEX可以有效降低機體的炎癥反應，同時抑制炎癥介質的釋放，有效保護炎癥介質對致器官的損傷。本研究以上結果的變化可能是因為DEX可以通過降低炎性介質的釋放，緩解肝竇擴張、中央靜脈淤血，促進肝組織的排毒，降低腸道內的內毒素含量水平，從而減輕腸道損傷。Pott等[16]研究表明，TNF-α還可以誘導死亡受體途徑介導的凋亡，誘導結腸炎大鼠腸上皮細胞凋亡，導致腸黏膜屏障功能下降，提示DEX可能通過抑制炎癥介質釋放，保護腸道功能。

腸道上皮細胞的凋亡及脫落是影響腸道功能的重要因素，而細胞的凋亡受到相關基因的調控。Caspase 家族蛋白在細胞凋亡信號傳遞和凋亡執行過程中的重要蛋白，當細胞凋亡途徑激活后，上游信號經傳遞能夠激活下游caspase-9的活化，放大凋亡信號，激活caspase-3，而凋亡信號一旦傳遞到caspase-3蛋白活化，細胞凋亡進入不可逆階段[17-18]。除了Caspase 家族，Bcl-2 家族也是一種常見的凋亡控制基因。Bcl-2家族中主要是由Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達量決定細胞是否凋亡[19-20]。Bax和Bcl-2表達呈相反趨勢，當Bcl-2 表達下降時Bax 表達上升，此時會促進細胞的凋亡；當Bcl-2 表達升高，而Bax表達降低時，則會抑制細胞的凋亡[21]。本實驗中可以看出，與模型組相比，使用DEX 處理各組大鼠腸組織Bcl-2 蛋白表達顯著升高，Bax 及Caspase-3 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。說明DEX可以通過抑制凋亡蛋白的表達，升高抑制凋亡蛋白的表達實現抑制腸道上皮細胞的凋亡。鄧麗靜等[22]研究表明，DEX 可以通過抑制腸細胞及免疫細胞的凋亡，本研究結果與其部分一致，提示DEX可可能通過抑制腸道細胞凋亡，發揮腸道保護。

綜上所述，DEX可以降低腸源性膿毒癥大鼠血清中過高的炎性因子，保護腸道黏膜，抑制腸道細胞的凋亡，減輕腸道腸道組織損傷。但本實驗涉及到的樣本量較少，本研究僅初步探討了DEX緩解腸源性膿毒癥大鼠腸道組織損傷的可能機制，其具體的機制在后續實驗將進一步驗證。