艾曲波帕在IFN-γ介導(dǎo)的炎性環(huán)境中對(duì)造血干細(xì)胞衰竭的影響機(jī)制研究

王 娟，雷 秦，許世娟

（陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院血液內(nèi)科，咸陽 712000）

干擾素（interferon，IFN）是人類發(fā)現(xiàn)最早的一類細(xì)胞因子，其中IFN-γ是Ⅱ型IFN中唯一的亞型，其可有效促進(jìn)細(xì)胞表面的MHCⅠ分子表達(dá)，提高人體的免疫監(jiān)視能力，在臨床應(yīng)用上具有重要的價(jià)值[1-4]。有研究指出，IFN-γ 在貧血和獲得性再生障礙中發(fā)揮著重要作用[5]，然而，IFN-γ 表達(dá)水平升高會(huì)導(dǎo)致血小板和中性粒細(xì)胞的減少[6]，從而影響機(jī)體造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells,HSPCs）的產(chǎn)生、分化、維持、更新等過程[7-8]。研究認(rèn)為，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路能促進(jìn)機(jī)體胚胎干細(xì)胞的造血分化[9]。ERK 信號(hào)通路的缺失會(huì)造成動(dòng)脈發(fā)育不完全，不利于患者HSPCs 的正常增殖[10]。因此，ERK信號(hào)通路的控制與HSPCs 是否順利產(chǎn)生具有顯著的相關(guān)性。艾曲波帕是一種促進(jìn)血小板新生激動(dòng)劑。研究報(bào)道，艾曲波帕能夠有效治療慢性免疫性的血小板減少性患者[11]。但目前關(guān)于艾曲波帕在IFN-γ介導(dǎo)的炎性環(huán)境中對(duì)HSPCs的作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討艾曲波帕對(duì)IFN-γ介導(dǎo)的炎性環(huán)境中調(diào)控ERK信號(hào)通路對(duì)HSPCs的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 重組人IFN-γ（貨號(hào)：TL-105）購自北京同立海源生物科技有限公司；重組人血小板生成素注射液（特比澳）（國(guó)藥準(zhǔn)字S20050049）由沈陽三生制藥有限責(zé)任公司提供；艾曲波帕（REVOLADE）由瑞士諾華公司提供。

1.2 細(xì)胞分組及處理 選取2018 年3 月至2019 年11月陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院的15例健康志愿者，年齡18～55歲，所有志愿者均已簽署實(shí)驗(yàn)知情同意書。本研究已取得機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。通過髂前上棘骨髓穿刺取得受試者的HSPCs，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分為3 組：IFN-γ 組（加入100 μg/L IFN-γ 培養(yǎng)24 h）、艾曲波帕組（加入3 g/mL艾曲波帕含藥血清培養(yǎng)24 h）、艾曲波帕+IFN-γ組（100 μg/L IFN-γ干預(yù)1 h后加入3 g/mL艾曲波帕含藥血清培養(yǎng)24 h），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.3 人CD34+HSPCs 的獲取與鑒定 連續(xù)5 d，每天給予受試者皮下注射10 μg/kg粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor,g-CSF），于第6天分離白細(xì)胞，并使用Clinimacs Plus儀器富集CD34+HSPCs后冷凍保存。對(duì)分離出的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，使用CD34+抗體檢測(cè)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞CD34+。使用BD 流式細(xì)胞儀（BD 公司，美國(guó)）和Tree Star FlowJo分析軟件分析調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD34+的數(shù)量。

1.4 RT-PCR 法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄激活因子1（ATF1）、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）、c-fos 和P27 mRNA表達(dá) 用Trizol試劑（上海碧云天公司）提取HSPCs 細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用TaqMan Universal PCR kit在熒光定量PCR儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：ABI7500）上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。以GAPDH 為內(nèi)參，Bandscan 5.0軟件通過積分光密度值分析ATF1、CREB、c-fos 和P27 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，采用2-△△t法計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工公司合成，引物序列如下：ATF1 上游：5’-CGCACGATATCTAGTGACAGAGG-3’，下游：5’-TGCAAACCTGTAGGGTAAAT-GG-3’；CREB上游：5’-TCAGCCGGGTACTACCATTC-3’，下游：5’-TCTCTTGCTGCTTCCCTG-3’；c-fos上游：5’-ACCAGCCCAGACCTGCAGTGG-3’，下游：5’-CCGGCACTTGGCTGCAGCCAT-3’；P27 上游：5’-GTCACGCGTATGTCAAACGAGTGTC-3’，下游：5’-ACCACTAGTTGACGTCTTCTGAGGCCAG-3’；GAPDH 上游：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，下游：5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’。

1.5 Western blotting 法檢測(cè)ATF1、CREB、c-fos、P27 和磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表達(dá) 取HSPCs，加入裂解液裂解細(xì)胞，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，SDSPAGE 電泳分離蛋白，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉1 h，PBS 緩沖液漂洗3 次，一抗ATF1（1∶1 000；美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)ASF000125）、CREB（1∶1 000；美國(guó)Sigma公司，批號(hào)BNO009587）、c-fos（1∶1 000，上海碧云天公司，批號(hào)2019-005247）、P27（1∶1 000，上海碧云天公司，批號(hào)2019-000957）、ERK（1∶1 000，上海碧云天公司，批號(hào)2019-0124450）和p-ERK 抗體（1∶1 000，美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)BGC010248）4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次，采用辣根酶標(biāo)記標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶5 000，美國(guó)Pierce公司，批號(hào)AB00987）室溫孵育2 h，PBS 緩沖液漂洗3 次。DBA 顯色，并于化學(xué)發(fā)光成像儀上進(jìn)行成像并拍照。各組細(xì)胞p-ERK 水平的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為作用12 h或24 h。采用Image J 6.0分析蛋白條帶灰度值。計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量（相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值×100%）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)；計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測(cè)量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艾曲波帕在IFN-γ介導(dǎo)的炎癥環(huán)境下對(duì)HSPCs的影響 艾曲波帕+IFN-γ 組CD34+細(xì)胞百分比為（50.22±3.10）%，顯著高于IFN-γ組的（30.17±2.13）%，顯著低于艾曲波帕組的（88.49±3.89）%（均P＜0.05）。

2.2 3組細(xì)胞p-ERK 相對(duì)表達(dá)量比較 作用12 h后，與IFN-γ組和艾曲波帕組比較，艾曲波帕+IFN-γ組細(xì)胞p-ERK均顯著升高（P＜0.05），而IFN-γ組和艾曲波帕組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；作用24 h 后，與IFN-γ 組比較，艾曲波帕組和艾曲波帕+IFN-γ 組細(xì)胞p-ERK 表達(dá)水平均顯著升高，艾曲波帕+IFN-γ組則較艾曲波帕組顯著升高（P＜0.05），見表1、圖1。

圖1 Western blotting法檢測(cè)p-ERK蛋白表達(dá)

表1 3組細(xì)胞p-ERK相對(duì)表達(dá)量比較%， ，n=5

表1 3組細(xì)胞p-ERK相對(duì)表達(dá)量比較%， ，n=5

與IFN-γ組比較，aP＜0.05；與艾曲波帕組比較，bP＜0.05。

2.3 3組細(xì)胞ATF1、CREB、c-fos 和P27 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 與IFN-γ 組比較，艾曲波帕組和艾曲波帕+IFN-γ組ATF1、CREB和P27 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，而c-fos 相對(duì)表達(dá)量顯著降低（均P＜0.05）；與艾曲波帕組比較，艾曲波帕+IFN-γ 組ATF1、CREB和P27 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，而c-fos 相對(duì)表達(dá)量顯著升高（均P＜0.05），見表2。

表2 3組細(xì)胞ATF1、CREB、c-fos和P27 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 3組細(xì)胞ATF1、CREB、c-fos和P27 蛋白表達(dá)量比較 與IFN-γ 組比較，艾曲波帕組和艾曲波帕+IFN-γ 組ATF1、CREB 和P27 蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，而c-fos相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與艾曲波帕組比較，艾曲波帕+IFN-γ 組ATF1、CREB和P27 蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，而c-fos相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 3組細(xì)胞ATF1、CREB、c-fos和P27蛋白表達(dá)量比較%，

表3 3組細(xì)胞ATF1、CREB、c-fos和P27蛋白表達(dá)量比較%，

與IFN-γ組比較，aP＜0.05；與艾曲波帕組比較，bP＜0.05。

圖2 Western blotting法檢測(cè)ATF1、CREB、c-fos和P27蛋白表達(dá)

3 討論

艾曲波帕片（REVOLADE）是一種促血小板生成素受體激動(dòng)劑適用于治療慢性免疫性血小板減少性紫癜患者的血小板減少，對(duì)皮質(zhì)激素、免疫球蛋白或脾切除反應(yīng)不佳的患者。近年來，眾多實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)艾曲波帕可通過刺激機(jī)體HSPCs 的增殖誘導(dǎo)免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)等過程，從而促進(jìn)機(jī)體系統(tǒng)造血功能恢復(fù)[12]。IFN-γ 是一種具有免疫和炎癥的有效性介質(zhì)，其在機(jī)體炎癥誘導(dǎo)反應(yīng)中，在貧血和獲得性再生障礙中發(fā)揮著重要作用[13]。研究顯示：造血過程中眾多信號(hào)調(diào)控通路之間存在著一定的相互作用，對(duì)機(jī)體HSPCs 的增殖、分化和更新等過程具有嚴(yán)密的調(diào)控機(jī)制[14-17]。本研究探究艾曲波帕在IFN-γ介導(dǎo)的炎性環(huán)境中對(duì)HSPCs衰竭的影響機(jī)制。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，艾曲波帕能夠在IFN-γ 的作用下激活機(jī)體CMPL 通路[18]。研究發(fā)現(xiàn)，艾曲波帕對(duì)骨髓衰竭患者中，亦具有一定的治療作用，包括自身免疫疾病或慢性感染等，而其與重組人血小板生成素（rhTPO）的比較中發(fā)現(xiàn)，rhTPO 能夠?qū)IK13/AKT、JAK2/STST-1信號(hào)通路具有傳導(dǎo)作用，而艾曲波帕僅能激活JAK2/STAT-1 信號(hào)通路，認(rèn)為rhTPO可有效促進(jìn)血小板聚集，艾曲波帕無此功能，可能原因與CMPL 的氨基酸序列位點(diǎn)不同相關(guān)[19-20]。研究顯示：在敲除STAT5a和5b的小鼠模型中，STAT 可與和DNA 結(jié)合并促使受損機(jī)體內(nèi)血小板的產(chǎn)生，證實(shí)JAK/STAT 通路和血小板的產(chǎn)生相關(guān)[21]。而當(dāng)機(jī)體內(nèi)Ras 通路被激活后，可進(jìn)一步激活ERK通路，進(jìn)而導(dǎo)致p90rsK磷酸化，促進(jìn)ERK下游多種因子ATF1、CREB磷酸化和c-fos轉(zhuǎn)錄[22]。

艾曲波帕不僅可促使巨核細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)血小板的生成，還有促進(jìn)骨髓HSPCs的增殖和分化，從而改善造血功能的作用，故批準(zhǔn)用于治療經(jīng)免疫抑制療法無效的重型再生障礙性貧血患者。艾曲波帕可能通過以下4 種機(jī)制在AA 治療中發(fā)揮作用：刺激并維持HSPCs，減少IFN 對(duì)HSPCs的抑制；促進(jìn)免疫耐受，抑制巨噬細(xì)胞活性、削弱樹突狀細(xì)胞成熟、增加調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞數(shù)量；免疫調(diào)節(jié)，進(jìn)而減少IFN及TNF的釋放、增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）釋放；還有一點(diǎn)的療效驗(yàn)證是鐵清除，可以促使細(xì)胞鐵動(dòng)員、減少鐵過載的現(xiàn)象。結(jié)合本研究結(jié)果筆者推測(cè)，艾曲波帕可在促炎細(xì)胞因子IFN-γ介導(dǎo)的炎癥環(huán)境中防止人類HSPCs和祖細(xì)胞衰竭，其機(jī)制與ERK通路激活下游多種蛋白激酶的表達(dá)密切相關(guān)。在免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭綜合征中，促炎細(xì)胞因子IFN-γ 參與人類HSPCs 和祖細(xì)胞的耗竭。IFN-γ復(fù)合物形成紊亂以及所導(dǎo)致的生長(zhǎng)因子細(xì)胞信號(hào)的重要通路抑制或可代表IFN-γ損害人HPSCs功能的一般機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)或可為各類慢性炎性疾病提供廣泛的治療應(yīng)用。

綜上所述，艾曲波帕能在IFN-γ 介導(dǎo)的炎癥環(huán)境中，通過ERK通路激活下游多種蛋白激酶的表達(dá)水平，達(dá)到防止HSPCs衰竭的作用。