外感二號合劑中葫蘆素B的鑒別和含量測定*

藍曉步，植國繁，許崇搖，黃興振，吳 瑞，盧文汐，秦艷娥Δ

（1.廣西南寧市第一人民醫院，南寧 530022；2.廣西醫科大學，南寧 530022）

外感二號合劑是山芝麻、鴨腳木、白點稱（崗梅）等多味藥材組成的醫療機構制劑。該合劑為南寧市第一人民醫院老中醫根據廣西南寧的地域和氣候特點而研制的驗方，經制劑室科學配制而成的純中藥制劑，取得批準文號（桂衛藥制字［1999］010067）并用于臨床。該合劑在院內臨床應用已有多年，經臨床驗證治療外感風熱所致的發熱、咽炎、支氣管炎等有明顯療效，具有清熱解毒、解表利咽的功效[1]。石玲東等[2]通過臨床觀察研究發現，運用苦柏洗劑聯合外感二號合劑治療普通型小兒手足口病具有顯著療效，對患兒口腔皰疹具有一定的治療作用，可促進病情恢復。方中山芝麻為君藥之一，收載于《廣西壯藥標準》第一卷[3]，性苦寒，味辛且苦，具有解表清熱、解毒消腫功效[4]。為有效地控制外感二號合劑的質量，本實驗通過研究建立了以山芝麻中葫蘆素B為指標的薄層色譜（TLC）鑒別及高效液相色譜（HPLC）含量測定方法，該方法可以作為外感二號合劑的質量標準之一。

1 材料與方法

1.1 儀器

ZF-8型四用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ULUP-I-10 型超純水機（四川優普超純科技有限公司）；XS-205DU型十萬分之一電子天平。

1.2 試劑

葫蘆素B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111945-201301）；外感二號合劑（南寧市第一人民醫院自制，批號分別為191101，200401，210101，規格為每瓶100 mL）；海洋牌硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號20181216）；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑為分析純，超純水（自制）。

1.3 TLC鑒別

1.3.1 條件 薄層色譜填料以硅膠G 為吸附劑，展開劑[5]：甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1），溫度28 °C，濕度40%，噴顯色劑10%硫酸乙醇溶液后，105°C加熱后置于365 nm紫外燈下檢視。

1.3.2 溶液的制備（1）供試品：取本品10 mL，加入60%乙醇40 mL，加熱回流1 h。過濾，置水浴中蒸干蒸干。殘渣加10 mL蒸餾水溶解。再用乙酸乙酯萃取2次，每次30 mL。合并萃取液，置水浴中蒸干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。（2）對照品[6]：精密稱取葫蘆素B適量，加甲醇溶解，定容，并稀釋成每1 mL 含葫蘆素B 1 mg 的對照品溶液。（3）對照藥材：稱取山芝麻對照藥材約5 g，依法制備對照藥材溶液。（4）陰性樣品：按處方制成缺山芝麻的陰性樣品溶液。取相當于供試品量，依法制成陰性樣品溶液。

1.3.3 點樣、展開、顯色 按照薄層色譜法[7]試驗，分別吸取葫蘆素B 對照品、供試品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品溶液各5 μL點于同一塊硅膠G預制板上，以甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴顯色劑10%硫酸乙醇溶液后105°C加熱15 min 后置于365 nm 紫外燈下檢視。外感二號合劑供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾，見圖1。

2 HPLC 含量測定方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為JADE-PAK ODS-AQ（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相[8]為乙腈-0.1%醋酸（46∶54，v/v）。流速定為1.0 mL/min，檢測波長設為228 nm[9-12]，注溫為室溫，進樣量設為10 μL。

2.2 溶液的制備

（1）對照品溶液的制備：精密稱取葫蘆素B 適量，加甲醇溶解，定容，并稀釋成每1 mL含葫蘆素B 1 mg 的對照品溶液[6]。（2）供試品溶液的制備：精密量取本品30 mL，加入60%乙醇適量，加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，加適量蒸餾水溶解。再用乙酸乙酯萃取2 次，每次30 mL。合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇適量，轉移置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試溶液。（3）陰性樣品溶液的制備：按外感二號合劑處方比例，除不加入山芝麻藥材外，依法制成缺山芝麻藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。

2.3 系統適用性試驗

分別取對照品溶液、供試溶液及陰性樣品溶液，按擬定色譜條件進樣10 μL，進行系統適用性試驗，記錄色譜圖。與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子為0.98，理論塔板數按葫蘆素B 計不低于5 000，見圖2。通過色譜圖對比，供試品中葫蘆素B的色譜峰與對照品色譜峰的保留時間基本一致，且陰性樣品在對應的位置上無色譜峰干擾。

圖2 HPLC圖

2.4 線性關系考察

精密稱取葫蘆素B 對照品，甲醇溶解，定容，配置成濃度為0.01 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.60 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL的標準溶液，按擬定色譜條件進行測定。以峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X，mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得葫蘆素B的回歸方程為Y=13 042 172.64X－59 373.34，r=0.999 9。葫蘆素B 質量濃度在0.01～1.00 mg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.5 精密度試驗

取同一份對照品溶液，按擬定色譜條件分別連續進樣測定6次，記錄各峰面積，結果葫蘆素B色譜峰面積的RSD值為0.28%，表明儀器精密度較好。

2.6 穩定性試驗

取同一批樣品（批號200401）配制的供試品溶液，按擬定色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h進樣，記錄葫蘆素B吸收峰的峰面積，結果葫蘆素B色譜峰面積的RSD值為0.61%（n=6），表明供試品的穩定性較好。

2.7 重復性試驗

取同一批次樣品（批號200401）6 份，同法制備供試品溶液，按擬定色譜條件平行測定6 次。結果葫蘆素B的RSD值為0.72%，表明方法重復性較好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的外感二號合劑（批號200401）6 份，每份15 mL，每份精密加入相同量的葫蘆素B，同法制備供試品溶液，按擬定色譜條件分別進樣測定，計算葫蘆素B 的平均回收率。葫蘆素B 的平均回收率為99.49%（RSD=1.77%，n=6），見表1。

表1 葫蘆素B的加樣回收率試驗結果 n=6

2.9 樣品含量測定

分別取3 個批號外感二號合劑各2 份，同法制備供試品溶液。按擬定色譜條件進樣測定，每份樣品測定2 次，計算外感二號合劑中葫蘆素B 的平均含量，見表2。

表2 外感二號合劑中葫蘆素B含量測定結果 n=2

3 討論

3.1 質量評價指標的選擇

由于外感二號合劑現行的質量標準較低，僅有性狀檢查，缺乏TLC 鑒別和含量檢查，不符合現代中藥制劑的質量管理要求，筆者擬通過本研究以提升該合劑的質量標準。方中的山芝麻作為君藥之一，具有解清熱、消腫解毒等功效[4]。山芝麻臨床上多用于治療由風熱感冒引起的癥狀，例如全身酸痛、鼻塞、咽喉紅腫熱痛、流涕、支氣管炎、發熱頭痛等[13-15]。本研究曾對山芝麻中齊墩果酸的含量開展了HPLC 方法測定相關成分含量的研究工作，但由于處方藥味較多，相互干擾太大，經文獻研究[16-17]發現，該合劑中的鴨腳木皮和白點稱（崗梅）這兩味藥材成分均含有齊墩果酸成分。有文獻報道[18]，葫蘆素B 為山芝麻的主要有效成分之一，通過實驗研究發現，葫蘆素B 在該合劑中可以區別于其他藥材的專屬性成分，故以葫蘆素B 作為外感二號合劑的質量評價指標，可作為特異性指標控制外感二號合劑的質量。

3.2 展開劑體系的摸索

TLC 實驗中，對環己烷—乙酸乙酯—甲酸（10:10:0.5）[19]和甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）[5]兩種展開劑系統進行了比較，相同條件下甲醇的提取效果最佳。甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）這一展開劑體系的色譜圖中斑點更清晰、分離度更好。故選取甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）作為展開劑。

3.3 流動相的選擇

參考文獻中[8]葫蘆科植物藥材中葫蘆素類成分的含量方法，曾選用乙腈-0.1%醋酸（49∶51，v/v）作為流動相，結果發現葫蘆素B和供試品的峰形不好，且拖尾嚴重。采用不同比例的乙腈-0.1%醋酸系統，對葫蘆素B對照品及樣品的出峰時間、理論板數、分離度和峰形等進行了比較。最終選擇了乙腈-0.1%醋酸（46∶54，v/v），其保留時間適合，分離度合格，比例拖尾情況較輕，理論塔板數按葫蘆素B 計不應低于5 000。

3.4 色譜柱的選擇

曾采用Phenomenex Luna?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、JADE-PAK ODS-AQ 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色譜柱分別進行樣品溶液的測定。以Phenomenex Luna?C18柱測得樣品溶液色譜圖中保留時間雖較良好，但其色譜峰形不好，因而沒有采用；而Kromasil 100-5C18柱測得的樣品溶液色譜圖中峰形比較差，故不予選用；JADE-PAK ODS-AQ色譜柱測得樣品溶液的葫蘆素B 保留時間適合，且與前后雜質峰分離效果均良好，分離度均大于1.5，符合《中國藥典》的規定。

3.5 方法評價

本研究中首次對外感二號合劑中山芝麻中藥材的葫蘆素B 進行定性鑒別及含量測定，建立的方法具有簡便快捷、穩定性好、準確度高、專屬性強等特點，可作為外感二號合劑定性及定量的質量標準。