腦缺血/再灌注損傷小鼠生物學特性及穩定性

趙 凱，陳曉雪，陳雅婧，賈宇臣*

(1.呼和浩特市第一醫院，呼和浩特 010030；2.內蒙古醫科大學分子生物學研究中心，呼和浩特 010059)

目前，腦血管病已成為世界范圍內主要疾病之一，其具有高發病率、高致殘率、高死亡率的特點[1]，成為中國第一位致死和致殘的原因，給社會和家庭帶來了沉重的經濟負擔[2]。全球范圍內每年新發腦卒中病例高達1 030萬[3]。中國面臨著世界上最大的卒中挑戰，卒中死亡排名第三[4-5]。腦血管病分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中發病率更高，約占85%，缺血性腦卒中是由腦部血管內狹窄或形成血栓, 栓子脫離堵塞血管，引起腦內局灶性缺血[6]。臨床上缺血性腦卒中的首要治療方式主要是盡快靜脈溶栓，然而只有少部分患者能在卒中發生后6 h時間窗內入院接受靜脈溶栓治療[7]，并且在治療過程中往往會導致缺血再灌注損傷[8]。因此，卒中的治療與預防成為神經科學研究領域的熱點之一。如何簡單、快速、穩定地建立卒中動物模型一直是一個棘手問題。大腦中動脈線栓法制備腦缺血模型是經典的栓塞模型，可以很好地阻斷大腦中動脈遠端缺血，與臨床血管閉塞部位類似度高[9]。但由于不同的操作手術程序，不同的處理對模型的成功和穩定性影響差異顯著。現參照Longa線栓法[10]，在線栓的插入方式、血管的分離及處理等方面進行探討，旨在建立一種操作簡單且穩定性高、成功率高、術后生存率高的腦缺血再灌注(cerebral ischemia/reperfusion，CI/R)損傷小鼠模型的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組

健康清潔級 C57BL/6小鼠70只，雄性，周齡5～6周，體重25～30 g，購于內蒙古大學動物中心[許可證號：SCXK(蒙)2016-0001]，適應性飼養1周以上，保持室溫25 ℃，相對濕度55%。采用隨機分組方式分為：假手術組(n=10)、頸總動脈(common carotid artery，CCA)進線組(n=30)及頸外動脈(external carotid artery，ECA)進線組(n=30)。

1.1.2 實驗試劑

水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑TTC(2,3,5-triphenyhetrazolium chloride，TTC，sigma Aldrich，T8877)，4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司，Cat#P1110)。

1.1.3 實驗儀器及材料

體式解剖顯微鏡(江西鳳凰光學科技有限公司，XTL-165)，電凝筆(德國臺電，V50)，手術顯微器械(張家港青松公司，77002、77007)，硅膠線栓(廣州佳靈生物科技有限公司，2000-20)。

1.2 實驗方法

1.2.1 缺血再灌注小鼠模型的制備

(1)ECA進線組小鼠模型制作過程。術前禁食24 h，自由飲水。4%水合氯醛按10 g體重0.1 mL劑量腹腔注射麻醉小鼠，5～10 min小鼠翻正反射消失后，將小鼠仰臥位固定于手術板上，75%醫用酒精消毒處理手術區，沿頸部正中偏右側約2 mm處剪開表皮，鈍性分離右側胸鎖乳突肌內側緣，分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)，枕動脈，頸內動脈(internalcarotid artery，ICA)；在CCA近心端處和ICA遠心端分別備手術縫合線一根，前者打活結，用于牽拉或防滲血，后者用于栓塞后固定線栓；用微血管動脈夾夾閉CCA、ICA，接著凝斷枕動脈，在ECA靠近頸動脈分叉(carotid bifuracation，CB)中間端用顯微剪剪一小口，將頭部直徑0.20 mm的線栓經該剪口插入，向CCA方向插入。確認線栓進入CCA后，使用電凝筆電灼ECA的遠心端后，牽拉ECA游離端及線栓一同反折，使之與ICA走向一致時，順勢緩慢將線栓推入ICA，當微感阻力時即停止送線，自CB處算起，線栓進入長度在9～10 mm，用預留在ICA遠心端的備用手術縫合線固定住線栓；在線栓推進過程中，若在大約5 mm處線栓感到強烈阻力，即可能是誤入了ICA的顱外唯一分支翼腭動脈(pterygo palatineartery, PPA)，此時將CCA提緊后，反復抽出、插入線栓，嘗試幾次后即可使線栓繼續順利深入；插入90 min后再灌注時再次麻醉小鼠，打開切口將線栓拔出，電凝ECA游離端，打開CCA近心端處活結，觀察頸總動脈恢復搏動，實現再通后縫合肌肉和皮膚[10]。術后，將小鼠置于37 ℃恒溫電熱毯上保溫。

(2)CCA進線組小鼠模型制作過程。CCA進線組血管分離與上述方法相同。分離出各血管后，在CCA遠心端和ICA遠心端備一根縫合線，線一用于牽拉阻斷血流，線二用于栓塞后固定線栓，微血管動脈夾夾閉CCA、ICA，在CCA靠近分叉處2～3 mm處剪一小口，線栓經該剪口順CCA插入ICA，當進栓深度9～10 mm微感阻力即停止送線，用預留手術縫合線固定住線栓，結扎CCA遠心端，90 min后再灌注時再次麻醉小鼠，打開切口，抽出線栓，永久結扎CCA與ICA，縫合肌肉和皮膚。術后，將小鼠置于37 ℃恒溫電熱毯上保溫。

(3)假手術組制作過程。假手術組將CCA、ECA、ICA分離后依次縫合肌肉和皮膚即可，不插入線栓。

1.2.2 神經缺損評分即成功率、存活率計算

術后24 h，參照Zea Longa方法進行神經功能評分：0分，無神經功能損傷表現；1分，表現為提尾懸空左前肢不能伸展，為輕度神經損傷；2分，表現為行走時向左側轉圈，為中度神經損傷；3分，行走困難，且向左側傾倒，為重度神經損傷；4分，無法自主行走或昏迷。1～3分為模型成功。剔除造模死亡及沒出現神經功能障礙的小鼠[11-12]。計算公式如下。

V=A1/A2×100%

(1)

S=B1/B2×100%

(2)

式中：V為模型成功率；A1為成功動物數量；A2為實驗動物總數；S為存活率；B1為存活動物數量；B2為實驗動物總數。

1.2.3 各組小鼠缺血再灌注后體重變化率情況

在術前、術后24 h測量各組小鼠體重，小鼠體重變化率計算公式為

W=(W1-W2)/W1×100%

(3)

式(3)中：W為小鼠體重變化率；W1為術前體重；W2為術后體重。

1.2.4 腦梗死體積的檢測

術后24 h后予以腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，立即斷頭取腦，去除嗅球、小腦和腦干，-20 ℃冷凍20 min后，從前往后行冠狀連續切片，厚度約為2 mm，將腦片浸泡于0.5% TTC染色液中，37 ℃避光孵育20 min。拍照，染色后正常腦組織呈紅色，梗死區呈白色。采用Image-Pro Plus6.0軟件測量計算腦梗死體積，相對腦梗死體積計算公式為

I=[(S′1+S′2+…+S′n)-(S1+S2+…+Sn)]/(S′1+S′2+…+S′n)×100%

(4)

式(4)中：S′1,S′2,…,S′n為各層正常側腦組織面積；S1,S2,…,Sn為各層梗死側非梗死區腦組織面積。

1.2.5 腦組織病理學觀察

小鼠經腹腔注射4%水合氯醛麻醉后，將小鼠仰臥位固定于手術板上，75%醫用酒精消毒處理胸部，眼科剪沿胸部正中線左側依次剪開表皮、肌肉和肋骨，暴露出心臟，剪去右心耳，用5 mL注射器吸取生理鹽水在心尖處注射，反復2～3次，直至右心耳處流出的液體不含血色后，吸取4%多聚甲醛經心尖處注入，內灌注固定，直至四肢變白，尾巴根部翹起。內灌注完成后，立即取出全腦置于4%多聚甲醛溶液24 h后，置于30%蔗糖溶液脫水過夜，石蠟包埋，行冠狀連續切片，厚度為4 μm，經蘇木素/伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，在光學顯微鏡下觀察腦組織形態學上的病理改變。

1.3 統計學分析

應用SPSS18.0軟件進行數據處理及統計分析，計量資料采用均數±標準差表示，組間采用方差分析，計數資料采用卡方檢驗，P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠術后神經功能缺損評分及存活率、成功率比較

神經功能缺損評分可以直觀判斷小鼠腦損傷程度及模型成功與否。缺血再灌注24 h，采用Zea Longa方法進行神經功能評定。如表1所示，ECA進線組存活率為90%，CCA進線組存活率為66.7%，兩組有顯著性差異(P=0.028)。兩組造模成功率為：ECA進線組83.3%，CCA進線組56.7%，差異有顯著性(P=0.024)。ECA進線組在2～3分比率占70.0%，CCA進線組占43.3%,差異有顯著性(P=0.037)。CCA進線組共30只，存活20只，死亡10只，其中3只為術中死亡，3只拔出線栓后2 h內死亡，4只次日死亡；ECA進線組共30只，存活27只，死亡3只，其中術中死亡1只，次日死亡2只。經解剖發現CCA進線組有5只小鼠顱底積血塊，可能為蛛網膜下腔出血；ECA組次日死亡的1只小鼠也有此情況。術中死亡推測為麻藥過量或神經損傷導致。

表1 小鼠模型神經功能評分及存活率

2.2 各組小鼠體重變化比較

術后24 h測量各組小鼠體重變化如圖1所示，CCA進線組變化率為16.9%±0.9%，ECA進線組變化率為19.0%±1.2%，各組間均有差異。從上述結果可以看出，24 h體重變化率ECA進線組大于CCA進線組(P<0.05)。

圖1 各組小鼠模型術前后體重變化率

2.3 各組小鼠腦梗死體積及穩定性的比較

腦梗死體積穩定性是判斷模型穩定性的方法之一，皮層和網狀體同時出現梗死灶為成功標志。術后24 h后，TTC染色結果如圖2所示，梗死體積統計結果如圖3所示。CCA進線組梗死體積百分比為37.20%±3.89%，ECA進線組梗死體積為33.20%±1.30%，兩組差異不顯著(P=0.057，P>0.05)。

圖2 各組小鼠腦組織TTC染色結果

圖3 各組小鼠腦梗死體積百分比

2.4 各組腦片蘇木素/伊紅染色病理學檢測比較

腦片經蘇木素/伊紅染色如圖4所示，在光學顯微鏡下可見，正常小鼠大腦皮層細胞大小一致，胞質均勻，胞膜清晰且完整。ECA組與CCA組模型小鼠梗死部位大腦皮層，細胞結構不完整，甚至完全消失，細胞出現空泡樣改變，細胞間連接呈網狀改變。

圖4 小鼠大腦皮層HE染色結果

3 討論與分析

腦血管病已成為中國各類疾病致死的第一病因，尤以缺血性腦卒中占絕大多數[13]。因此，如何建立一個穩定性高、操作簡易的動物模型對腦血管病分子機制的研究備受關注。但由于小鼠腦血管側枝循環比較多，大大影響了模型的成功率及穩定性，故諸多學者致力于改進方法的研究[14-15]。

利用線栓法制作大腦中動脈栓塞模型是研究腦缺血疾病重要依托，隨著生命科學的發展，小鼠已經成為目前研究的熱點[16]。建立穩定的小鼠缺血模型，對研究腦血管病的發生、發展機制的研究至關重要。Longa線栓法有點頗多，術中對動物的血壓、體溫等影響較小，且穩定性強，重復性好，被廣泛應用[17-18]。

研究發現，ECA進線組與CCA進線組相比較，前者能夠提高MCAO/R模型的生存率和成功率且腦梗死體積同樣穩定，神經功能評分及TTC染色結果支持此研究結果。線栓法制作缺血模型，主要有兩種進栓方式，一種是直接從頸總動脈經頸內動脈入顱，另一種是從頸外動脈經頸內動脈入顱。對這兩種進栓方式進行了比較，CCA進線組模型采用前一種線栓插入方式，此方式操作方便，省去了剪斷和電凝ECA殘端這一過程，但再灌注時拔出線栓后需將頸總動脈結扎，通過前后交通動脈實現再灌注，導致再灌注血流是非正常生理性的；ECA進線組線栓插入方式采用后者，除了分離頸內動脈還需進一步分離頸外動脈，但去除線栓實現再灌注后可以電凝頸外動脈殘端，進而實現四條供應腦組織血流的動脈完全再通，保證了頸總動脈的完整性，以減輕對小鼠造成的創傷，更加接近生理性再通，提高了模型小鼠的成功率和術后存活率。小鼠術后24 h體重變化率提示，ECA進線組較CCA進線組及假手術組相比體重變化更高，這可能是ECA進線組在拔出線栓實現再灌注時因未結扎頸內動脈導致出血造成的差異，但體重的變化并未影響小鼠的存活率。傳統方法選擇結扎PPA，研究也在前期嘗試結扎了PPA，但因PPA位置較深，操作費力耗時，增加對小鼠的額外損傷，也存在血栓風險，很多實驗也已不再結扎PPA[14]，故正式實驗時未采用。

線栓的制備是模型成功的關鍵，Longe法[5]選擇將線栓頭部用火焰燒成圓形，起到使線栓頭部光滑不宜戳破血管和增大直徑使大腦中動脈完全堵塞的作用。但經過前期嘗試發現此種線栓處理方式不能保證每根線栓頭部直徑一致，增加了不穩定因素。而且由于魚線頭部沒有彈性，很難穩定實現完全阻塞血流，直徑過大不易進入顱內深部血管增加血管破裂風險，直徑過小起不到完全阻斷血流的效果。還有的研究使用石蠟包被魚線，因石蠟包被易操作、耗時短、性質穩定不易與血液成分反應，而且石蠟表面光滑，不易損傷血管壁。但經前期實驗發現在魚線誤入PPA反復抽拉魚線時，魚線頭部包被的石蠟易脫落，反而增加栓塞風險；硅膠線栓頭部包裹硅膠，直徑使線栓直徑增大有彈性且光滑，當線栓向深部走行至較細血管時即不會撐破血管又可有效阻斷血流，同一批次的硅膠線栓可以保證直徑一致。故研究采用硅膠線栓，提高了模型成功率。

實驗動物的性別、體重對模型的成功也有影響，有研究發現雌激素對缺血大腦具有保護作用雄性動物大腦對缺血缺氧敏感性高于雌性動物[18]，故實驗采用雄性小鼠；前期實驗發現體重大于35 g的小鼠造模生存率高，但TTC染色結果梗死灶卻不明顯，可能是體重大的小鼠血管也相應變粗，導致線栓不能完全阻塞大腦中動脈的原因。體重小于25 g的小鼠因血管太細線栓插入困難，導致模型失敗。因組內小鼠體重差異越小越有利于減少實驗誤差，故實驗采用25～30 g的小鼠，提高了模型成功率。

對水合氯醛的濃度也進行了摸索，水合氯醛是動物實驗中常用的麻醉藥之一，常選用的劑量為10%，0.3～0.4 mL/100 g[14-15,19]，有研究建議C57BL/6雄性小鼠的手術造模實驗水合氯醛按5%，0.1 mL/10 g給藥[19]，在實驗過程中發現采用4%水合氯醛比5%和10%水合氯醛安全且同樣有效麻醉，能減少小鼠術中死亡例數，提高了小鼠的存活率。

實驗的不足是未進行長期的術后觀察，如因CCA結扎與否是否影響了術后進食，不能得出兩組模型小鼠術后長期生存率是否依舊存在差異。但研究結果提示經ECA進線方式與經CCA進線方式相比，在腦梗死體積同樣穩定的情況下，經ECA進線的方法提高了術后24 h模型小鼠的成功率和生存率，有利于相關動物實驗的開展。