沉默GRP78表達(dá)增強(qiáng)HOS細(xì)胞對(duì)MPPα-PDT敏感性的研究①

左 強(qiáng) 歐云生 余浩洋 鐘申熹 張木子（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶400016）

骨肉瘤是青少年常見的骨原發(fā)惡性腫瘤之一，伴隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步及新輔助治療出現(xiàn)，患者的總體生存率有所提高，但骨肉瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是治療的難題［1-2］。光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT）作為一種治療時(shí)間窗短、毒副反應(yīng)小、可重復(fù)治療的新型治療惡性腫瘤的方法，已廣泛運(yùn)用于臨床相關(guān)惡性腫瘤的治療［3-4］。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是一種關(guān)鍵的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔內(nèi)分子伴侶，具有強(qiáng)大的抗凋亡特性，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的增殖和存活密切相關(guān)［5-7］；此外，有研究表明，GRP78也是腫瘤細(xì)胞抗性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與腫瘤的耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8-9］。在乳腺癌及結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，沉默GRP78表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性［10-11］，但GRP78在PDT治療骨肉瘤中的研究較少。本研究將運(yùn)用siRNAGRP78干擾人骨肉瘤細(xì)胞HOS中GRP78的表達(dá)，并探討其對(duì)焦脫鎂葉綠酸-α甲酯介導(dǎo)的光動(dòng)力療法（MPPα-PDT）作用下HOS細(xì)胞增殖活性、凋亡水平及Wnt通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑 人骨肉瘤HOS細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。焦脫鎂葉綠酸-α甲酯（pyropheophorbide-α methyl ester，MPPα）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基等均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑及Hoechst凋亡試劑盒均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-PI雙染檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海MedChemExpress公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；RNA提取試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海東洋紡生物科技公司；PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；干擾GRP78基因（siRNA-GRP78）由上海漢恒生物科技有限公司合成，序列如下：正義鏈5'-CCAAAGACGCUGGAACUAUTT-3'，反 義 鏈5'-AUAGUUCCAGCGUCUUUGGTT-3'，siRNA陰性對(duì) 照，序列如下：正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'，反義鏈5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'。兔抗人GRP78多克隆抗體、兔抗人βactin多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體均購(gòu)自中國(guó)武漢三鷹公司；兔抗人Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗人Ki67、兔抗人PCNA、兔抗人PKT、兔抗人GSK3β、兔抗人β-catenin多克隆抗體購(gòu)自中國(guó)武漢賽維爾生物科技有限公司；兔抗人P-AKT、兔抗人P-GSK3β均購(gòu)自中國(guó)博士德生物工程有限公司；Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器 光動(dòng)力治療儀購(gòu)自重慶京渝激光生物研究所；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)B&D Biosciences公司；倒置熒光顯微鏡、正置熒光顯微鏡均購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 人骨肉瘤HOS細(xì)胞的培養(yǎng) 人骨肉瘤HOS細(xì)胞株用含有0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素與10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的孵箱中避光培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)，常規(guī)傳代。

1.2.2 PDT處理HOS細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤HOS細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化，按實(shí)驗(yàn)分組傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度為50%～60%時(shí)，避光加終濃度為0.15 μmol/L的光敏劑MPPα，繼續(xù)避光培養(yǎng)20 h，經(jīng)波長(zhǎng)630 nm、40 mW/cm2的連續(xù)輸出方式，光照120 s，繼續(xù)在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行避光孵育［12］。

1.2.3 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤HOS細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化，6孔板中按Control組、MPPα組、LED組、MPPα-PDT 24 h組分組。MPPα-PDT處理后，根據(jù)操作說(shuō)明每孔加入Hoechst固 定 液 固 定15 min，PBS洗 凈，每 孔 加 入Hoechst33342染料1 ml染色5 min，PBS洗凈殘余染料，倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞細(xì)胞核變化。

1.2.4 脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA-GRP78轉(zhuǎn)染HOS細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HOS細(xì)胞，接種于6孔板，分組如下：Control組、siRNA-NC組、siRNA-GRP78組，取15 ml離心管，每孔HOS細(xì)胞加入125 μl DMEM培養(yǎng)基，加入100 pmol siRNA，混勻，加入4 μl Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置20 min，最后每孔加入125 μl上述混合液，輕輕搖勻，轉(zhuǎn)染6 h，更換為完全培養(yǎng)基，72 h后可行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 qPCR法檢測(cè)GRP78 mRNA的表達(dá)水平細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78 72 h后，Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，采用10 μl上樣體系依次上樣，運(yùn)用以下上機(jī)程序：95℃、30 s，共1個(gè)循環(huán)；90℃、5 s，60℃、30 s，65℃、5 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，引物序列分別為：β-actin上游：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游：5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'；GRP78上游：5'-CACGCCGTCCTATGTCGC-3'，下 游：5'-AAATGTCTTTGTTTGCCCACC-3'。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并計(jì)算GRP78基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按5 000個(gè)/孔接種于96孔板。分為Control組、siRNA-GRP78組、siRNA-GRP78+MPPα-PDT組及MPPα-PDT組，分別于處理后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h檢測(cè)HOS細(xì)胞增殖活性。根據(jù)CCK-8檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明按每孔加入10 μl CCK-8溶液和90 μl DMEM培養(yǎng)液混合液，孵育箱中反應(yīng)1 h。用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)為450 nm處測(cè)定各孔的OD值。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組平均OD值-調(diào)零孔OD值）/（空白組平均OD值-調(diào)零孔OD值）×100%。

1.2.7 Western blot檢測(cè)GRP78蛋白、凋亡相關(guān)蛋白及Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨肉瘤HOS細(xì)胞，按1.2.6中方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組，行相關(guān)處理后提取細(xì)胞蛋白。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白（β-catenin、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β）表達(dá)。Image Lab 5.2.1軟件分析目的條帶，以目標(biāo)蛋白與β-actin灰度值比值作為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HOS骨肉瘤細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HOS細(xì)胞，按1.2.6中方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組，行相應(yīng)處理后，PBS緩沖液洗3次，胰酶消化，離心，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀，每組收集3個(gè)批次細(xì)胞樣本，Annexin V-PI試劑雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.2.9 免疫熒光檢測(cè)GRP78蛋白熒光強(qiáng)度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HOS細(xì)胞，接種于6孔板中25 mm細(xì)胞爬片，按1.2.6中方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組，按1.2.1中方法相應(yīng)處理，繼續(xù)避光孵育12 h。4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS洗3次，0.1%TritonX-100破膜15 min，山羊抗兔血清封閉40 min，兔多克隆GRP78抗體稀釋后（1∶100）4℃過(guò)夜孵育。避光條件下加入Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG熒光二抗室溫下孵育40 min，PBS洗3次，DAPI染核5 min，PBS洗凈殘余DAPI，封片，正置熒光顯微鏡觀察。采用Image J 1.52e軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用±s表示。組內(nèi)兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用方差分析；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MPP α-PDT可誘導(dǎo)HOS細(xì)胞發(fā)生凋亡Hoechst凋亡染色（圖1A）提示，與Control組、LED組、MPPα組相比，MPPα-PDT-24 h組中HOS細(xì)胞核可見高亮藍(lán)色以及核碎裂、固縮等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。流式細(xì)胞術(shù)（圖1B、C）提示MPPα-PDT 3 h、6 h、12 h、24 h組中凋亡率隨時(shí)間增加而升高（P＜0.01）。

圖1 HOS細(xì)胞凋亡形態(tài)變化（A）及凋亡率檢測(cè)（B、C）Fig.1 Detection of morphological changes of HOS cell apoptosis（A）and apoptosis rate（B，C）

2.2 MPPα-PDT可 誘 導(dǎo)HOS細(xì)胞GRP78表達(dá)增高Western blot（圖2）顯示，與Control組比較，MPPα-PDT處 理HOS細(xì) 胞3 h、6 h、12 h、24 h組GRP78表達(dá)水平增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且12 h表達(dá)量最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot結(jié)果提示，在骨肉瘤HOS細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)MPPα-PDT處理后，GRP78在12 h表達(dá)水平最高。故選用12 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 Western blot檢測(cè)MPPα-PDT處 理后HOS細(xì)胞 中GRP78蛋白表達(dá)Fig.2 GRP78 protein expression level in HOS cells after MPPα-PDT treatment was detected by Western blot

2.3 siRNA-GRP78有效沉默人骨肉瘤HOS細(xì)胞中GRP78的表達(dá)Western blot（圖3A、B）顯示，與Control組比較，siRNA-GRP78組骨肉瘤HOS細(xì)胞中GRP78蛋白的表達(dá)水平降低（P＜0.05），siRNA-NC組GRP78蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。qPCR法（圖3C）顯示，與Control組相比，siRNAGRP78組骨肉瘤HOS細(xì)胞中GRP78 mRNA的表達(dá)水平降低，干擾率約為74.60%（P＜0.05），siRNA-NC組與Control組之間相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。骨 肉 瘤HOS細(xì) 胞 中siRNA-GRP78組 對(duì)GRP78 mRNA的干擾率約為74.60%。以上結(jié)果表明，siRNA-GRP78有效地干擾了HOS細(xì)胞中GRP78的表達(dá)。

圖3 siRNA-GRP78對(duì)HOS細(xì)胞 中GRP78蛋白和mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of siRNA-GRP78 on expression of GRP78 protein and mRNA in HOS cells

2.4 沉默GRP78表達(dá)降低人骨肉瘤HOS細(xì)胞的增殖活性GRP78蛋白免疫熒光（圖4A、B）顯示，與Control組比 較，siRNA-GRP78組 及siRNA-GRP78+MPPα-PDT組中GRP78平均熒光強(qiáng)度均降低（P＜0.05），MPPα-PDT組中GRP78平均熒光強(qiáng)度增加（P＜0.05）；與MPPα-PDT組比較，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組GRP78平均熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05）。

CCK-8法（圖4C）檢測(cè)結(jié)果表明，與Control組比較，siRNA-GRP78組、MPPα-PDT細(xì)胞增殖活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與MPPα-PDT組相比，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05）。

Western blot（圖4D、E）檢測(cè)顯示，與Control組比較，siRNA-GRP78組、siRNA-GRP78+MPPα-PDT組及MPPα-PDT組中增殖蛋白PCNA、Ki67表達(dá)均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與MPPα-PDT組比較，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組中PCNA、Ki67蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，siRNA-GRP78可降低HOS細(xì)胞的增殖活性，同時(shí)可增強(qiáng)MPPα-PDT對(duì)細(xì)胞增殖活性的抑制作用。

圖4 GRP78表達(dá)對(duì)HOS細(xì)胞增殖活性的影響Fig.4 Effect of expression of GRP78 on proliferation activity of HOS cells

2.5 沉默GRP78表達(dá)上調(diào)人骨肉瘤HOS骨肉瘤細(xì)胞的凋亡水平Western blot（圖5A、B）檢測(cè)顯示，與Control組比較，siRNA-GRP78組、MPPα-PDT組及siRNA-GRP78+MPP-PDT組Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與MPPα-PDT組相比，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3表達(dá)都明顯上升（P＜0.01）。

圖5 各組HOS細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及凋亡率檢測(cè)Fig.5 Detection of expression of apoptosis-related proteins and apoptosis rate of HOS cells

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果（圖5C、D）顯示，siRNA-GRP78組HOS細(xì) 胞 的 凋 亡 率 為（13.93±1.06）%，高于Control組（5.98±0.51）%（P＜0.05）；siRNA-GRP78+MPPα-PDT組 凋 亡 率 為（51.99±2.15）%，高于MPPα-PDT組（32.19±2.79）%和siRNA-GRP78組（P＜0.05）。以上結(jié)果提示沉默GRP78表達(dá)增加HOS細(xì)胞的凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，并且增加MPPα-PDT作用下的細(xì)胞凋亡水平。

2.6 沉默GRP78表達(dá)可抑制MPPα-PDT誘導(dǎo)HOS細(xì)胞中Wnt通路的激活Western blot（圖6）檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，siRNA-GRP78組中p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β及β-catenin等Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；與MPPα-PDT組比較，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β及β-catenin等Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，沉默GRP78表達(dá)可有效抑制MPPα-PDT處理后HOS骨肉瘤細(xì)胞中Wnt通路的激活。

圖6 Western blot檢測(cè)Wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.6 Expression levels of Wnt pathway related proteins were detected by Western blot

3 討論

PDT是一種治療效果顯著的新型治療腫瘤方法，MPPα作為新型的第二代光敏劑，能夠特異性富集在腫瘤部位，然后利用特定波長(zhǎng)的光照射腫瘤，使光敏劑發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［13］。腫瘤細(xì)胞在受到外界不利刺激后，會(huì)迅速誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活未折疊蛋白反應(yīng)，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微環(huán)境的穩(wěn)定，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)外界刺激的適應(yīng)性［14-15］。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣穩(wěn)態(tài)及控制傳感器的激活，調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)，使細(xì)胞微環(huán)境恢復(fù)穩(wěn)態(tài)［16-17］。本研究結(jié)果顯示，MPPα-PDT作用于HOS細(xì)胞后，可誘導(dǎo)HOS細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且能夠激活未折疊蛋白反應(yīng)，使GRP78表達(dá)的增加。

GRP78作為一種多功能蛋白折疊伴侶和共受體，具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡特性，在人類發(fā)育和疾病中起著關(guān)鍵作用，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［18-19］。在腫瘤細(xì)胞中，GRP78能夠激活“促生存”通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)不利刺激的適應(yīng)性，使腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療產(chǎn)生抗性［20］。在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌的研究中，腫瘤組織中GRP78表達(dá)較高，并與腫瘤的化療抗性與復(fù)發(fā)相關(guān)［21］。在復(fù)發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究中，GRP78表達(dá)較高的細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖與成瘤性［22］。本研究結(jié)果顯示，siRNA-GRP78沉默HOS骨肉瘤細(xì)胞中GRP78表達(dá)后，HOS細(xì)胞的增殖蛋白及增殖活性下降，凋亡蛋白上調(diào)，表明GRP78在HOS細(xì)胞中起抗凋亡、促增殖的作用。

GRP78的重要性在各種癌細(xì)胞的研究中得到證實(shí)，目前認(rèn)為GRP78主要通過(guò)激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［23-24］。在肝癌中發(fā)現(xiàn)，GRP78通過(guò)靶向LRP6激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移［25］。在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)，沉默GRP78可以通過(guò)干擾Wnt配體的糖基化在體外抑制Wnt信號(hào)，從而增強(qiáng)結(jié)腸癌干細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性［26］。在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移與Wnt信號(hào)通路激活相關(guān)，并且以GRP78為靶點(diǎn)的藥物異甘草素通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性［27-28］。在骨肉瘤研究中發(fā)現(xiàn)，化療藥物可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞Wnt通路激活，抑制該通路可增加化療對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的敏感性［29］。β-catenin作為Wnt通路的核心蛋白，受上游分子GSK3β、AKT的調(diào)節(jié)，磷酸化GSK3β（p-GSK3β）及磷酸化AKT（p-AKT）作為其活化形式，可促進(jìn)下游分子β-catenin激活，βcatenin入核后積累，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游靶基因，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用［27］。本研究結(jié)果顯示，與Control組比較，siRNA-GRP78組中AKT、GSK3β稍下降，p-AKT及p-GSK3β明顯下降，且p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比例及β-catenin均明顯下降，表明有效沉默GRP78后，Wnt通路相關(guān)蛋白受抑制；同理，與Control組比較，MPPα-PDT組中Wnt信號(hào)通路中p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比例及βcatenin均增加，表明MPPα-PDT可誘導(dǎo)HOS骨肉瘤細(xì)胞中Wnt通路激活；同時(shí)，與MPPα-PDT組比較，siRNA-GRP78+MPPα-PDT組中Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)均下降，表明有效沉默GRP78后，可抑制MPPα-PDT誘導(dǎo)HOS細(xì)胞Wnt通路的激活。

綜上所述，骨肉瘤HOS細(xì)胞經(jīng)過(guò)MPPα-PDT處理后，HOS細(xì)胞中GRP78表達(dá)增高；并且沉默GRP78表達(dá)后，骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖活性下降、凋亡水平上調(diào)；同時(shí)，沉默GRP78表達(dá)可抑制MPPα-PDT誘導(dǎo)下的骨肉瘤Wnt通路激活，提示沉默GRP78增加骨肉瘤HOS細(xì)胞對(duì)MPPα-PDT的敏感性可能與抑制Wnt通路激活相關(guān)，這為沉默GRP78靶點(diǎn)聯(lián)合MPPα-PDT治療骨肉瘤提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。