IL-1β基因修飾的脂肪間充質干細胞移植治療急性肝衰竭的實驗研究①

徐楊超 賴 青 吳 堅 汪 煒 鄭 敏（江西醫學高等專科學校，上饒334000）

急性肝衰竭是由病毒、酒精、藥物等多種病因引起的大量肝細胞死亡導致的肝功能障礙與失代償［1-2］，其有效治療方法為原位肝移植，但由于存在供體短缺、排斥反應、價格較貴與疾病進展較快等問題限制了其臨床應用。隨著干細胞學、肝細胞再生與免疫學方面研究的深入開展，使得再生醫學臨床治療終末期肝病成為可能。

脂肪間充質干細胞（adipose derived mesenchymal stem cell，ADSC）是一類具有多向分化潛能、免疫調控功能與自主更新能力的干細胞，可被誘導分化為肝樣細胞，參與細胞的趨化與黏附，發揮抗纖維化與免疫調節作用來治療肝臟疾病［3-5］。通過搭載目的基因以強化或改善ADSCs功能活性，增強其對急性肝臟衰竭的保護作用，對進一步發掘ADSCs的作用和價值意義重大。作為IL-1的主要形式，IL-1β對肝細胞具有保護作用［6］。因此本實驗主要觀察IL-1β基因修飾的ADSCs移植治療急性肝衰竭的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物6周齡健康雄性SD大鼠57只，體重（210±15）g，SPF級，其中54只用于急性肝衰竭模型的建立，另外3只用于ADSCs的分離培養。將所有動物飼養于18～25℃，相對濕度40%～60%的環境中，12 h/12 h明暗交替，自由進食水，適應性喂養1周后進行實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 戊巴比妥鈉（57-33-0，上海氟德化工有限公司）；胎牛血清、DMEM完全培養（百恩維生物科技有限公司）；IL-1β（I2393-10UG，Sigma-Aldrich）；D-氨基半乳糖（化夏化學北京公司）；谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；質粒Helper1.0、Helper2.0（吉凱基因有限公司）；熒光顯微鏡（BX43，南京伊若達儀器設備有限公司）；流式細胞儀（RZ，上海然哲儀器設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分離培養［7］腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，備皮后在腹部做1個十字切口，皮下游離至腹股溝，獲取脂肪組織約2 g，以含雙抗的PBS清洗3次；將剪碎的脂肪組織分裝入50 ml離心管內，以1∶2比例加入0.075%的Ⅰ型膠原蛋白酶，37℃條件下80 r/min水浴振蕩60 min；按照膠原酶的量加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，1 500 r/min離心11 min后去上清，將5 ml紅細胞裂解液加入細胞沉淀中裂解5 min。PBS清洗后經細胞篩過濾，隨后轉移至新的離心管內1 500 r/min離心5 min，去上清，以含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的DMEM完全培養基重懸細胞，置于37℃、含5%CO2的細胞培養箱內培養。約24 h后細胞貼壁，更換培養基，此后每3 d換液1次。當細胞貼壁達到約80%時，以1∶2比例傳代。取生長狀態良好的第3代細胞用于實驗。

1.2.2 ADSCs的鑒定 將第3代ADSCs以胰酶消化后計數，利用細胞培養基重懸細胞，以2×106的細胞密度加入流式管內，分別加入FITC標記的流式抗體CD29、CD34、CD45、CD49d、CD90，通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原。

1.2.3 IL-1β體外誘導ADSCs的分化 將第3代ADSCs以1×105個/孔接種于置有細胞爬片的6孔板，細胞貼壁24 h后分4組：分別加入20 μg/L肝細胞生長因子（HGF組）、20 μg/L肝細胞生長因子+5 μg/L IL-1β（HGF+5IL-1β組）、20 μg/L肝細胞生長因子+10 μg/L IL-1β（HGF+10IL-1β組）、20 μg/L肝 細 胞 生 長 因 子+20 μg/L IL-1β（HGF+20IL-1β組），各組均加入10%胎牛血清。待細胞爬片達到90%時換液，加入2 ml含對應誘導因子的L-DMEM培養基，每3 d換液1次。誘導分化21 d內進行免疫組化染色，利用Imagepro plus圖像處理系統分析白蛋白與角蛋白陽性表達率。

1.2.4 ADSCs的基因修飾 根據大鼠IL-1β基因序列設計并合成引物，F：5'-GCGTTTAAACATGCACAGCTCAGCCACTG-3'，R：5'-GCGTTTAAACTCAGTTTCGTATCTTCAT-3'。PCR擴增獲取目的基因片段后，利用限制性內切酶酶切工具載體GV358，將其產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶后獲得線性化載體，將線性化載體與目的基因擴增產物進行重組反應，實現線性化載體和目的基因片段的體外環化，獲得慢病毒表達載體IL-1β-Lv-GV358。將10 μl慢病毒表達載體IL-1β-Lv-GV358與100 μl感受態細胞DH5α混合均勻，進行單克隆PCR鑒定與測序，獲得高純度的慢病毒質粒IL-1β-Lv-GV358。將慢病毒質粒IL-1β-Lv-GV358與輔助包裝質粒Helper1.0、Helper2.0共同轉染至293T細胞。轉染48 h后收集細胞上清液；4℃、4 000 g離心10 min，上清液以0.45 μm濾器過濾，置于40 ml超濾離心管中4℃、25 000 r/min離心2 h，收集沉淀并加入病毒保存液重懸。沉淀溶解后10 000 r/min離心5 min，收集慢病毒上清液并分裝。采用熒光法檢測病毒滴度。將第3代ADSCs以5×104個/孔接種于96孔板，加入100 μl完全培養基后置于細胞培養皿內培養。當細胞生長達到30%融合時棄原培養液，以感染復數=100進行轉染，向各孔中加入10 μl病毒液、10 μl Ploybrene增強液和80 μl完全培養基，置于細胞培養皿內培養。12 h后更換為常規培養基。轉染48 h后，熒光顯微鏡觀察轉染情況，Western blot法檢測IL-1β蛋白表達。

1.2.5 實驗動物分組與干預 將54只SD大鼠隨機分3組，分別為模型組、未轉染組、轉染組，18只/組。3組均建立急性肝衰竭模型。急性肝衰竭模型的建立：腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹腔注射1 400 mg/kg D-氨基半乳糖建立急性肝衰竭大鼠模型［8］。病理觀察驗證實驗造模成功。將慢病毒IL-1β-Lv-GV358轉染的ADSCs與未轉染的ADSCs分別置于培養皿中培養，當細胞密度達到90%以上時棄掉培養基，加入CM-Dil熒光標記液孵育20 min，進行移植實驗。造模24 h后，轉染組尾靜脈注射1 ml慢病毒IL-1β-Lv-GV358轉染的ADSCs，未轉染組尾靜脈注射1 ml ADSC，模型組尾靜脈注射1 ml生理鹽水，兩治療組移植的細胞數為1×106個。

1.2.6 檢測指標

1.2.6.1 肝功能檢測 移植后24 h、48 h、72 h每組隨機取大鼠6只，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，內眥靜脈取血1 ml后置于EP管內，4℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清，檢測谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素濃度。嚴格按照相關試劑盒說明書操作。

1.2.6.2 肝臟病理分析 移植后24 h、48 h、72 h采集血清后取部分肝組織，進行石蠟包埋，切片（切片厚度約4 μm），常規HE染色，顯微鏡下觀察肝臟炎癥與壞死情況。利用HAI評分系統對肝臟組織炎癥壞死程度進行計分，該評分系統分別按界面性炎癥及橋接壞死的程度按0～10分評定；按小葉內肝細胞變性和壞死范圍及匯管區的炎癥狀況分別記為0～4分，按纖維化的程度分別記1～4分。總評分0～22分，總分越高說明肝臟病理改變越嚴重。

1.3 統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件包分析處理，計量數據以±s表示，符合正態分布的多組獨立樣本比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較進行Student-Newman-Keuls配對t檢驗。各檢驗的顯著性水平均設定為P＜0.05。

2 結果

2.1 ADSCs的鑒定 大鼠ADSCs高表達CD29、CD49d、CD90表面抗原，低表達CD34、CD45表面抗原，符合MSCs表面抗原表達特征（圖1）。

圖1 ADSCs的表面抗原檢測Fig.1 Surface antigen detection of ADSCs

2.2 IL-1β體外誘導ADSCs分化 未加入生長因子誘導的ADSCs形態呈長梭形，而加入肝細胞生長因子與IL-1β誘導因子的ADSCs形態發生明顯變化，誘導第7天時細胞由成纖維細胞形態轉變化上皮樣細胞形態，至誘導第21天時，大多數細胞以類圓形為主，呈現肝樣細胞形態（圖2）。

圖2 ADSCs向肝樣細胞的分化（×100）Fig.2 Differentiation of ADSCs into hepatocyte like cells（×100）

未加入肝細胞生長因子與IL-1β誘導因子的ADSCs未見白蛋白與CK18蛋白表達。加入肝細胞生長因子與IL-1β誘導因子的ADSCs白蛋白與CK18蛋白均呈陽性表達，且隨著誘導時間的延長，各組白蛋白與CK18蛋白陽性表達增加，同時隨著誘導因子IL-1β濃度的增加，相同時間下的白蛋白與CK18蛋白陽性表達增加（表1）。

表1 各組ADSCs中白蛋白與CK18蛋白陽性表達（±s，n=5，%）Tab.1 Positive expression of albumin and CK18 protein in ADSCs of each group（±s，n=5，%）

表1 各組ADSCs中白蛋白與CK18蛋白陽性表達（±s，n=5，%）Tab.1 Positive expression of albumin and CK18 protein in ADSCs of each group（±s，n=5，%）

Note：Compared with HGF group，1）P＜0.01；compared with HGF+5IL-1β group，2）P＜0.01；compared with HGF+10IL-1β group，3）P＜0.01.

Groups HGF HGF+5IL-1β HGF+10IL-1β HGF+20IL-1β 24 h 15.30±1.21 30.29±4.231）46.38±3.791）2）78.38±5.251）2）3）Albumin 48 h 42.16±3.41 59.88±2.661）74.32±3.111）2）84.04±4.771）2）3）72 h 69.09±5.42 77.88±2.641）84.38±3.191）2）94.36±2.111）2）3）24 h 8.96±2.17 24.33±3.241）39.86±4.771）2）59.26±5.941）2）3）CK18 protein 48 h 20.37±4.36 40.81±6.351）68.99±5.821）2）79.38±4.511）2）3）72 h 48.68±6.78 71.09±3.271）82.09±4.991）2）92.45±6.191）2）3）

2.3 ADSCs的慢病毒轉染 熒光顯微鏡下轉染重組慢病毒IL-1β-Lv-GV358與Lv-GV358的ADSCs可見大量綠色熒光表達，細胞熒光陽性率為98%（圖3A、B）；Western blot檢測顯示，轉染重組慢病毒IL-1β-Lv-GV358 ADSCs的IL-1β蛋白表達量明顯高于未轉染重組慢病毒的ADSCs，差異有統計學意義（圖3C、D）。

圖3 ADSCs的慢病毒轉染Fig.3 Lentivirus transfection of ADSCs

2.4 肝功能的檢測 移植后24 h、48 h、72 h模型組谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素值持續升高，同組不同時間點間各指標值比較差異有統計學意義。移植后24 h和48 h，未轉染組谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素值持續升高，同組不同時間點間各指標值比較差異存在統計學意義；移植后72 h，未轉染組谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素值降低。移植后24 h、48 h、72 h，轉染組谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素值持續降低，同組不同時間點間各指標值比較差異有統計學意義。移植后48 h和72 h，未轉染組與轉染組的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素值低于模型組（P＜0.05），轉染組的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素值低于未轉染組（P＜0.05），見表2。

表2 各組肝功能的比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of liver function of each group（±s，n=6）

表2 各組肝功能的比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of liver function of each group（±s，n=6）

Note：In the same group，compared with 24 h after transplantation，1）P＜0.05；in the same group，compared with 48 h after transplantation，2）P＜0.05；at the same time point，compared with model group，3）P＜0.05；at the same time point，compared with non transfection group，4）P＜0.05.

Transplant time 24 h 48 h 72 h Transplant time 24 h 48 h 72 h Transplant time 24 h 48 h 72 h Model 276.25±16.40 428.55±29.611）546.88±38.171）2）Model 298.15±39.51 412.37±54.221）567.34±61.201）2）Non transfected 256.37±17.36 389.36±12.551）3）302.66±10.771）2）3）Aspartate aminotransferase（U/L）Non transfected 271.85±29.63 379.11±19.881）3）302.53±15.621）2）3）Total bilirubin（μmol/L）Transfected 246.23±9.16 188.18±6.771）3）4）108.14±5.481）2）3）4）Transfected 265.39±20.97 199.64±23.591）3）4）99.85±18.641）2）3）d Model 37.29±2.79 89.66±5.411）128.57±5.661）2）Alanine aminotransferase（U/L）Non transfected 36.28±2.21 44.26±3.551）3）31.41±2.341）2）3）Transfected 33.18±3.45 25.72±3.871）3）4）17.22±3.111）2）3）4）

2.5 肝臟病理 移植后24 h，模型組肝細胞水腫，可見點狀變性壞死與炎性滲出，提示急性肝衰竭造模成功；此后肝臟壞死程度逐漸加重，至移植后72 h時肝細胞呈大片狀壞死，結構明顯破壞，可見大量炎癥細胞浸潤。移植后24 h，兩細胞移植治療組也可見肝細胞水腫、點狀變性壞死與炎性滲出，至移植后48 h時，該兩組肝臟病理改變較模型組明顯改善；移植后72 h時，兩細胞移植治療組肝臟病理進一步改善，且轉染組改善情況好于未轉染組，僅見肝細胞點狀壞死及小量炎癥細胞浸潤（圖4）。

圖4 各組移植后72 h肝臟組織病理（HE，×200）Fig.4 Liver histopathology 72 h after transplantation in each group（HE，×200）

根據HAI評分系統對肝臟組織炎癥壞死程度計分，移植后24 h時3組評分比較差異無統計學意義；轉染組與未轉染組移植后48 h、72 h的評分低于模型組（P＜0.05），轉染組移植后48 h、72 h的評分低于未轉染組（P＜0.05），具體結果見表3。

表3 各組肝臟組織病理評分（±s，n=6）Tab.3 Pathological score of liver in each group（±s，n=6）

表3 各組肝臟組織病理評分（±s，n=6）Tab.3 Pathological score of liver in each group（±s，n=6）

Note：In the same group，compared with 24 h after transplantation，1）P＜0.05；in the same group，compared with 48 h after transplantation，2）P＜0.05；at the same time point，compared with model group，3）P＜0.05；at the same time point，compared with non transfection group，4）P＜0.05.

Groups Model Non transfected Transfected 24 h after transplantation 4.7±0.8 4.5±0.6 4.4±0.5 48 h after transplantation 14.3±1.51）10.6±0.91）3）8.3±0.71）3）4）72 h after transplantation 16.3±0.81）2）8.9±0.41）2）3）4.9±0.22）3）4）

2.6 ADSCs在肝內的存活 肝臟病理切片如圖5所示，顯示，移植的脂肪間充質分布在肝組織中央靜脈周圍與肝竇中，同時也可見轉染組的熒光強度高于未轉染組。

圖5 大鼠肝組織內移植的ADSCs（熒光顯微鏡，×100）Fig.5 Transplanted ADSCs in rat liver tissue（fluorescence microscope，×100）

3 討論

急性肝衰竭常用的治療方法為保肝、降酶、退黃疸及相應的對癥治療，臨床療效不甚理想，而肝移植治療又存在供體缺乏、費用昂貴等問題，因此尋找新的方式治療肝衰竭至關重要。移植MSCs、肝祖細胞及造血干細胞等是治療肝臟疾病很有前途的方法。ADSCs來源廣泛，取材容易，增殖能力與擴增能力強，免疫排斥反應小，且不存在倫理問題，具有較廣闊的臨床應用前景。目前有關ADSCs移植治療肝衰竭的研究較多，但多集中于細胞體外培養與誘導分化方面［9］，體內移植研究相對較少。

目前ADSCs移植治療肝衰竭的機制尚未完全明確，主要有以下幾種途徑［10］：①抑制肝細胞凋亡：急性肝衰竭后肝細胞大量凋亡，ADSC可通過分泌抗凋亡因子來抑制細胞凋亡，進而發揮治療作用；②抑制肝纖維化：急性肝衰竭時肝細胞凋亡伴隨而來的是肝內星狀細胞大量增生，肝纖維化形成，ADSC移植可通過分泌增加血管內皮生長因子與肝細胞生長因子分泌來抑制肝纖維化；③抑制炎癥反應與免疫調節：急性肝衰竭后免疫因子活化，分泌大量炎癥介質，而MSCs移植可促進M2型巨噬細胞增殖與血管內皮生長因子分泌，抑制炎癥反應；④分化為肝樣細胞：移植的ADSCs可被誘導分化為肝樣細胞，參與肝臟組織修復。

目前已有基因工程技術研究在移植前對ADSCs進行靶基因轉染，以進一步提高ADSCs的存活率與目的基因的表達，成為新的治療熱點。白細胞介素是在白細胞或免疫細胞間相互作用的淋巴因子，其中的IL-1具有免疫調節作用，可與活化APC及T細胞協同促進B細胞增殖及分泌大量抗體，誘導肝臟急性期蛋白合成。同時IL-1β為參與炎癥反應的主要細胞因子，可激活T細胞與巨噬細胞，抑制內皮細胞的增殖并誘導其表達黏附分子，從而誘發炎癥細胞的募集與浸潤，導致組織損傷，尤其是肝臟組織［11］。因此，降低炎癥反應在急性肝衰竭治療中具有重要所用。如MA等［12］通過尾靜脈注射IL-1β siRNA腺病毒液與骨髓MSCs來治療小鼠急性肝衰竭，結果顯示IL-1β siRNA腺病毒可有效降低急性肝衰竭小鼠體內的炎癥反應，并可通過提高移植骨髓MSCs的存活增殖其組織修復能力與再生能力，二者聯合應用具有協同肝臟保護作用。但與MA等［12］研究不同的是，本實驗將IL-1β直接轉染至ADSCs中移植治療急性肝衰竭，得到了可促進急性肝衰竭大鼠肝功能的恢復、降低肝組織病理評分、加快肝臟組織的修復的結論，筆者認為，雖然IL-1β是損傷肝組織釋放的重要炎癥因子，但其又是MSCs發揮免疫抑制功能的生長因子，并可增強MSCs向受損組織的遷移、定植與黏附能力，增加各種生長因子的表達及分泌。已有研究顯示將MSCs與肝細胞共培養時，MSCs可通過分泌IL-1、IL-6與IL-10等促進肝細胞的生長，延長肝細胞生存時間［13］。還有研究證實促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α等可增加肝細胞生長因子的表達［14］。IL-1β為IL-1的主要存在形式，存在于血液中，具有與TNF-α相似的生理與代謝作用，并能夠與TNF-α協同發揮作用。

體外實驗顯示，IL-1β聯合肝細胞生長因子可誘導ADSCs轉化，誘導分化的細胞白蛋白與CK18蛋白表達陽性，提示白細胞介素聯合肝細胞生長因子可誘導ADSCs分化為肝樣細胞，并且這種誘導作用呈現出時間與劑量依賴性。為了進一步驗證體外實驗結果，將IL-1β以慢病毒感染的方式轉染至ADSCs，觀察其治療急性肝衰竭的效果。實驗結果顯示相對于模型組，移植ADSCs可改善急性肝衰竭模型大鼠的肝功能，降低肝臟病理評分，加快損傷肝臟的修復，證實了尾靜脈移植的ADSCs可歸巢至肝臟組織內發揮修復作用。而兩細胞移植組間也具有明顯差異：與單純的ADSCs移植相比，IL-1β基因修飾的ADSCs移植治療可進一步改善急性肝衰竭模型大鼠的肝功能，降低肝臟病理評分，加快損傷肝臟的修復。

因此，課題組推測IL-1β可能通過促進ADSCs的增殖、遷移與分化來增強其治療急性肝衰竭的效果。但本研究未進行體內肝向分化檢測，其結果有待進一步探討。