實驗性自身免疫性腦脊髓炎與腸道免疫微環境相關性的Meta分析

劉曉君 彭小燕 馬金昀 程曉東

（上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院臨床免疫研究所，上海200437）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是中樞神經系統以炎性脫髓鞘為主要病理特點的自身免疫性疾病，臨床表現以肢體癱瘓、感覺異常、共濟失調、視力障礙、精神異常等反復發作的神經功能障礙為主，具有高復發率、高致殘率和難治愈等特點［1-2］。MS的確切病因目前尚未完全闡明，遺傳因素和環境因素（如EB病毒感染、低維生素D狀態、吸煙、腸道微生態系統）都共同參與MS的發生發展［3］。MS及其動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）常伴隨腸道微生物群結構的變化，腸黏膜屏障完整性的破壞和腸道免疫系統的激活，繼而通過菌-腸-腦軸上行途徑觸發中樞神經系統的炎癥和神經變性。MS患者的腸道免疫微環境與健康人群相比存在明顯差異，如MS患者腸道通透性增加、炎性Th17細胞數目增多等，其均與腸道微生物群的特異性改變密切相關［4-5］。研究發現，無菌（germ free，GF）小鼠經菌群移植接受來自MS患者的腸道菌群后誘導EAE，與接受來自健康人群腸道菌群的GF小鼠相比，其神經癥狀明顯加重［6-7］。此外，在無菌小鼠與無特定病原體（specific pathogen free，SPF）小鼠的EAE動物模型中，無菌EAE小鼠發病時間延后，神經癥狀評分降低，并伴隨腸道和脊髓中IFN-γ和IL-17等炎癥細胞因子分泌的減少，抑制炎性的CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例顯著升高［8］。

較多研究表明腸道菌群的失調、腸道免疫功能的紊亂與中樞神經系統疾病的發生發展密切相關［9-11］，而動物實驗是臨床前基礎研究的關鍵步驟，經過嚴格評估的動物實驗結論可作為開展臨床研究的證據支持。因此本研究旨在通過Meta分析對MS動物模型EAE與腸道免疫微環境變化的關系進行系統性分析，以期更深入地認識MS的發病機理，為后續臨床研究的開展提供可靠的循證醫學證據。

1 資料與方法

1.1 檢索策略 以“實驗性自身免疫性腦脊髓炎”“腸道菌群”“腸道微生物群”“腸道免疫”“腸道黏膜免疫”“腸道T淋巴細胞”“腸道B淋巴細胞”“腸道巨噬細胞”“腸道樹突狀細胞”等為中文檢索詞，檢索CNKI的中國學術期刊全文出版總庫、維普中文科技期刊數據庫、萬方中國學術期刊數據庫等中文數據庫。以“Experimental autoimmune encephalomyelitis”“EAE”“Microbiota”“Microbiome”“Gut or Intestinal immunity”“Gut or Intestinal mucosal immunity”“Gut or Intestinal T cell”“Gut or Intestinal B cell”“Gut or Intestinal Macrophage”“Gut or Intestinal Dendritic cell”等為英文檢索詞，檢索Pubmed、Science Direct和Medline英文數據庫。檢索時間為建庫至2020年1月8日，檢索語言無限制。

1.2 文獻納入標準 ①研究設計類型為對照研究，不限制其是否實施隨機分組；②研究對象為EAE嚙齒類動物疾病模型，對動物種屬和來源不進行限制，對具體造模方法亦不限制；③結局指標為EAE模型腸道菌群豐度及腸道內淋巴細胞百分比；④原始文獻為公開發表文獻。

1.3 文獻排除標準 ①重復報道或針對同一研究對象的多個文獻（納入樣本量最大、質量最好的）；②數據不完整，無法提取原始數據統計的文獻；③無法獲取原文的文獻；④會議論文、學位論文；⑤綜述文獻。

1.4 文獻資料提取2名研究者對最初搜索所得文章的標題進行相關性審查，并使用研究納入/排除標準對文章摘要進行評估，對初篩后所得文章進行全文閱讀，以進一步審查是否符合納入標準。2名研究者對納入的文獻獨立地進行數據提取和質量評價，并交叉核對，如遇分歧則由第三方裁決。文獻提取內容包括：第一作者/發表時間、動物種屬、動物周齡、動物性別、研究例數、隨機方法、結局指標等。

1.5 文獻偏倚風險評估2名研究者根據SYRCLE中心定制的SYRCLE動物實驗偏倚風險評估工具（SYRCLE's Risk Of Bias Tool For Animal Studies），對納入的文獻進行偏倚風險評估［12-13］。該工具是專門適用于動物實驗內在真實性評估的工具，包括6種偏倚類型的10個條目：①選擇性偏倚（序列產生、基線特征、分配隱藏）；②實施偏倚（動物安置隨機化、盲法）；③測量偏倚（隨機性結果評估、盲法）；④失訪偏倚（不完整數據報告）；⑤報告偏倚（選擇性結果報告）；⑥其他偏倚。評估結果以“是”“否”和“不確定”分別代表“低偏倚風險”“高偏倚風險”和“不確定偏倚風險”。2名研究者分別獨立進行偏倚風險評分，并進行交叉驗證，當意見不一致時，經討論后尋求第三方建議。

1.6 統計學分析 采用Cochrane協作網推薦的Review Manager 5.3軟件進行Meta分析。對于連續性資料，腸道內淋巴細胞百分比及腸道菌群豐度采用均數差（mean difference，MD）及95%CI為療效分析統計量，以P＜0.05為差異有統計學意義。采用I2值衡量各研究間異質性大小，I2≥50%采用隨機效應模型，并分析其異質性來源，I2＜50%采用固定效應模型［14］。對無法進行數據合并的結局指標，采用描述性方法進行分析。原始數據通過GetData Graph軟件獲取，連續性數據參照劉海寧等［15］的方法進行提取。

2 結果

2.1 檢索結果 通過關鍵詞檢索，本研究共檢索到1 176篇文獻與“腸道免疫”“腸道菌群”和“實驗性自身免疫性腦脊髓炎”相關的文章，其中Pubmed 588篇，Science Direct 172篇，Medline 416篇。經過EndNote軟件查重后，排除重復文獻898篇，對剩余247篇文獻進行標題和摘要閱讀，排除非病例對照研究、非動物實驗、與主題明顯不相符的文獻166篇，剩81篇文獻進行全文閱讀，排除與主題無關、無數據或數據不相關、無法獲取原文等文獻，最終納入8篇，全部為英文文獻，其中，與腸道免疫相關3篇，與腸道菌群相關5篇，具體文獻檢索流程見圖1。

圖1 文獻檢索流程及結果Fig.1 Flow chart of literature search and study selection process

2.2 文獻納入情況 本研究共納入發表年份在2013年至2019年間的8篇文獻，共納入123例研究對象，其中樣本量最少3例，最多24例。5項研究觀察了模型組與對照組腸道菌群相對豐度的差異，3項研究觀察了模型組與對照組腸道Th17、Treg的百分比。納入文獻的基本特征見表1。

表1 納入文獻的基本特征Tab.1 Details of included studies

2.3 偏倚風險評估 偏倚風險評估的具體結果見表2。納入的8個對照實驗中，僅有2個實驗研究采用隨機數字表法進行了隨機分組，其他研究均未詳細描述說明。

表2 納入研究的SYRCLE偏倚風險評估結果Tab.2 SYRCLE bias risk assessment results of inclusion researches

2.4 Meta分析結果

2.4.1 模型組與正常組乳酸桿菌屬 共3篇文獻研究了乳酸桿菌屬的變化［16-18］。Meta分析結果顯示Note：Animal：B.BALB/C mice，C.C57BL/6 mice，N.NOD mice，H.HLA-DR3.DQ8 transgenic mice；Gender：F.Female；NA.Not available；C.Control，M.Model；Outcome assessment：（1）.Th17，（2）.Treg，（3）.Lactobacillus，（4）.Bacteriodetes，（5）.Verrucomicrobia，（6）.Alistipes，（7）.Tenericutes，（8）.Firmicutes.各研究之間存在較高的異質性（I2=73%，P＜0.05），故采用隨機效應模型進行數據合并分析，Meta分析結果顯示：MD=-3.26，95%CI：-5.06，-1.47，P=0.000 4，差異有統計學意義，表明EAE模型組腸道內有益菌乳酸桿菌顯著減少。見圖2、表3。

圖2 Lactobacillus相對豐度比較的Meta分析Fig.2 Meta analysis of Lactobacillus relative abundance comparison

2.4.2 模型組與正常組擬桿菌門 共2篇文獻研究了擬桿菌門的變化［19-20］。Meta分析結果顯示各研究之間未見明顯的異質性（I2=0%，P＞0.01），故采用固定效應模型進行數據合并分析，Meta分析結果顯示：MD=-4.44，95%CI：-7.31，-1.57，P=0.002，差異有統計學意義，表明EAE模型組腸道擬桿菌門顯著減少。見圖3、表3。

圖3 Bacteriodetes相對豐度比較的Meta分析Fig.3 Meta analysis of Bacteriodetes relative abundance comparison

2.4.3 模型組與正常組疣微菌 共2篇文獻研究了疣微菌的變化［19-20］。Meta分析結果顯示各研究之間存在很高的異質性（I2=93%，P＜0.01），故采用隨機效應模型進行數據合并分析，Meta分析結果顯示：MD=11.72，95%CI：5.95，17.49，P＜0.000 1，差異有統計學意義，表明EAE模型組腸道內疣微菌顯著高于正常對照組。見圖4、表3。

圖4 Verrucomicrobia相對豐度比較的Meta分析Fig.4 Meta analysis of Verrucomicrobia relative abundance comparison

2.4.4 模型組與正常組Alistipes菌屬 共2篇文獻研究了Alistipes菌屬的變化［17-18］。Meta分析結果顯示各研究之間存在很高的異質性（I2=97%，P＜0.01），故采用隨機效應模型進行數據合并分析，Meta分析結果顯示：MD=-1.52，95%CI：-6.35，3.31，P=0.54，差異無統計學意義，表明Alistipes菌屬變化與EAE之間無顯著相關性。見圖5、表3。

圖5 Alistipes相對豐度比較的Meta分析Fig.5 Meta analysis of Alistipes relative abundance comparison

2.4.5 模型組與正常組柔膜菌門 共2篇文獻研究了柔膜菌門的變化［19-20］。Meta分析結果顯示各研究之間存在很高的異質性（I2=98%，P＜0.01）。采用隨機效應模型進行數據合并分析，I2=98%，Meta分析結果顯示：MD=-0.67，95%CI：-2.63，1.29，P=0.50，差異無統計學意義，表明柔膜菌門變化與EAE之間無顯著相關性。見圖6、表3。

圖6 Tenericutes相對豐度比較的Meta分析Fig.6 Meta analysis of Tenericutes relative abundance comparison

表3 腸道菌群相對豐度比較的Meta分析Tab.3 Meta-analysis of relative abundance of intestinal microbiota

2.4.6 模型組與正常組厚壁菌門 共2篇文獻研究了厚壁菌門的變化［19-20］。Meta分析結果顯示各研究之間存在很高的異質性（I2=80%，P＜0.05）。采用隨機效應模型進行數據合并分析，I2=80%，Meta分析結果顯示：MD=-1.67，95%CI：-9.22，5.88，P=0.66，差異無統計學意義，表明厚壁菌門變化與EAE之間無顯著相關性。見圖7、表3。

圖7 Firmicutes相對豐度比較的Meta分析Fig.7 Meta analysis of Firmicutes relative abundance comparison

2.4.7 模型組與正常組腸道Th17細胞 納入的3篇文獻報道了模型組與正常組腸道內Th17細胞的百分比。Meta分析結果顯示各研究之間存在很高的異質性（I2=100%，P＜0.01），因此這一數據不進行合并分析，采用描述性分析。DUC等［17］2019年的研究中模型組RORγT+IL-17+T細胞百分比為（18.73±5.85）%，正常組百分比為（11.85±2.63）%，差異有統計學意義，P＜0.05。NOURI等［21］2014年的研究中模型組CD3+IL-17+T細胞百分比為（30.53±2.26）%，正常組百分比為（5.09±0.85）%，差異有統計學意義，P＜0.001。SUZANA等［22］2017年的研究中模型組Th17細胞百分比為（1.75±0.53）%，正常組百分比為（0.26±0.18）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4.8 模型組與正常組腸道Treg納入的3篇文獻報道了模型組與正常組腸道內Treg細胞的百分比［17，21-22］。Meta分析結果顯示各研究之間存在很高的異質性（I2=95%，P＜0.01），采用隨機效應模型進行數據合并分析，Meta分析結果顯示：MD=-1.74，95%CI：-2.85，-0.63，P=0.002，差異有統計學意義。見圖8。

圖8 腸道內Treg比較的Meta分析Fig.8 Meta analysis of Treg in the intestine

3 討論

本研究系統性地評價了已發表數據關于MS動物模型EAE腸道菌群，腸道內Th17、Treg淋巴細胞變化的結局指標。共3篇文獻研究了乳酸桿菌屬的變化［16-18］，由于存在較高異質性，對納入研究進行敏感性分析，在排除MANGALAM等［16］2017的研究后異質性顯著下降（I2=0%，P＞0.05），或排除LI等［18］的研究后異質性顯著下降（I2=0%，P＞0.05）；對異質性較大的文獻進行分析，MANGALAM等［16］2017研究所用的對象為轉基因小鼠，而其余兩組為C57BL/6小鼠，實驗對象的差異可能造成了較大的異質性；LI等［18］的研究中，相比其余兩項研究，研究對象樣本量較大，實驗對象數量的差異可能造成了較大的異質性。共2篇文獻研究了疣微菌的變化［19-20］，對納入的2篇文獻進行異質性分析，兩項研究中研究對象背景、飼養環境、周齡、樣本量、造模方式等均相當，二者觀察時間點不同可能是異質性較大的來源。共2篇文獻研究了Alistipes菌屬的變化［17-18］，因存在較高的異質性，對兩篇文獻進行異質性分析，發現兩項研究中研究對象種類及樣本量存在的顯著差異可能是異質性較高的主要來源。納入的3篇文獻［17，21-22］報道了模型組與正常組腸道內Treg的百分比，因研究存在很高的異質性，采用敏感性分析，剔除NOURI等［21］2014的研究后異質性顯著降低（I2=34%）。對異質性較大的文獻進行分析，發現該研究中動物模型為過繼轉移型EAE，研究對象模型存在的差異可能是異質性較高的主要來源。本研究結果顯示，EAE鼠腸道內存在菌群結構的改變，乳酸桿菌和擬桿菌含量顯著減少，而疣微菌門含量增加，Alistipes菌、厚壁菌、柔膜菌門含量未見顯著變化。模型組腸道內Th17細胞高于正常組，模型組腸道內Treg細胞低于正常組，差異有統計學意義。

研究表明，MS患者腸道微生物群、腸道免疫細胞與健康人相比存在明顯差異。MS患者腸道中甲氧短桿菌、嗜黏蛋白-艾克曼菌、不動桿菌等菌群顯著富集，而隸屬擬桿菌門的丁酸弧菌等數量明顯減少［6-7，23］，口服益生菌（乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬）可緩解MS患者癥狀，促進有益菌乳桿菌屬含量的增加［24］。在MS動物模型研究中，腸道菌群被認為是發生脫髓鞘的初始介導因子［25］。Albino oxford（AO）大鼠對EAE的誘導具有極強的抵抗力，抗生素對AO大鼠腸道微生物群的擾動改變了腸道微生物群的組成，伴隨Peyer氏結、腸系膜淋巴結中調節性T細胞比例減少，導致AO大鼠表現出EAE癥狀，CNS中觀察到更多的炎性浸潤和更高的IL-17產生，而將AO腸道菌群移植到易患EAE的豚鼠身上改善了疾病的嚴重程度［26］。表明腸道菌群、腸道免疫的變化與MS/EAE的發生發展密切相關。

MS目前被廣泛認為是由遺傳因素和環境因素相互作用共同導致的自身免疫性疾病。輔助性T細胞（T helper cell，Th）17型是MS關鍵的致病細胞，是第一批透過血腦屏障浸潤CNS的外周淋巴細胞［27］。盡管Th17被認為是MS的核心致病細胞，但其在外周激活的部位仍不明確。研究表明，腸道微環境是允許自身反應性T細胞遷移到大腦的主要部位，是控制CNS髓鞘特異性T細胞的重要部位之一［28］。EAE是研究MS的經典動物模型，因此，確定MS動物模型EAE小鼠腸道內淋巴細胞情況對探索MS的病因和病理機制具有重要意義。在EAE小鼠模型中，髓鞘特異性T細胞的激活及分化為致病性的Th17細胞主要發生在腸道內［29-30］。在主動免疫和過繼免疫的兩種EAE模型中，研究者觀察到在中樞神經癥狀發生之前，腦源性Th17優先浸潤結腸固有層，通過阻斷過繼免疫模型中α4β7整合素途徑可以特異性地阻斷Th17的腸內歸巢，從而緩解EAE疾病的嚴重程度［31］。DITTEL等［32］發現腎上腺皮質激素可通過減少腸道固有層中細胞因子IL-6的分泌，減少促炎性Th17的分化，增加Foxp3+Treg數量，從而減輕EAE小鼠臨床癥狀評分，阻止疾病的進程。腸道內Th17的過度激活、Treg的缺失及抑制性功能的缺陷均可能參與EAE的發病，雖然其確切的作用機制尚未完全明確。

Th17細胞組成性地表達于回腸、結腸固有層［33］，其發育依賴于腸道內微生物群，同時，也是控制病原微生物所必需的，有助于維持腸道正常免疫功能，可動員和招募先天免疫細胞到病原體感染部位清除致病菌，而過度誘導的Th17則會導致腸道免疫功能紊亂，擴大腸道內免疫反應，從而引發自身免疫性疾病。腸道菌群有利于腸道黏膜免疫系統的發育和免疫調控，可通過直接或間接方式誘導和調節T細胞的增殖分化來維持腸道黏膜免疫的平衡，協調機體的免疫耐受［34-35］。腸道菌群的改變可通過發育致病性T細胞而參與MS的發生和發展［36］。Treg及其分泌的抑制性細胞因子IL-10和TGF-β在維持腸道免疫耐受方面發揮至關重要的作用，可以阻止異常的自身免疫反應發生［37-38］。Th17與Treg相互拮抗、制約，是維持正常的機體整體免疫功能和腸道免疫屏障功能中關鍵的因素，二者的失衡在MS/EAE發病機制中起著重要作用［39］，表明腸道內Th17、Treg淋巴細胞與EAE之間存在相關性，并參與了EAE疾病的進程。

本研究納入的8篇文獻研究對象樣本量相對較少，納入的動物實驗在隨機序列產生方法、盲法的使用等方法報告不充分，不能確定潛在偏倚風險。此外，動物實驗重要的基線特征未闡明，隨機分配在目前尚未成為動物實驗的標準實踐模式，各研究觀察環境、嚙齒類動物來源、腸道部位、腸道淋巴細胞、造模方式、疾病觀察時間點等不同，均可能是造成結果偏倚的因素，因此本研究在進行資料合并時，存在結局指標異質性較大的問題。腸道免疫受多種因素的影響（飲食、藥物、菌群等），且其變化在疾病的過程中呈動態發展，此外腸道不同部位免疫應答亦不相同。因此，未來仍需更多大樣本以及高質量的隨機對照試驗來證明腸道菌群及腸道免疫系統在MS/EAE中扮演的確切角色，以期提供可靠的有價值的循證醫學證據。

綜上所述，本文系統地總結了MS動物模型EAE與腸道免疫微環境（包括腸道菌群，腸道內Th17、Treg淋巴細胞）之間的關系，發現二者密切相關。EAE模型鼠腸道菌群結構存在明顯的改變，并伴有腸道免疫穩態（腸道Th17、Treg細胞）的變化。靶向腸道菌群和腸道免疫的治療可能影響到MS/EAE的發生與發展，為多發性硬化的治療提供新的思路與策略。