基于PI3K/Akt/GSK-3β通路探究葛根素減輕癲癇小鼠癥狀的機制

管 萍 劉文娟 盧鵬超 徐萌萌（湖北省天門巿第一人民醫院神經內科，天門431700）

癲癇（epilepsy，EP）是一種臨床常見的慢性神經系統疾病，具有進行性和反復性等特點，由大腦神經細胞過度異常放電引起，持續發作可引發腦內氧化應激及炎癥，損傷腦組織，造成大腦認知功能障礙，并增加患者患精神疾病的風險，腦卒中、腦外部損傷、神經系統過度放電等均可引發癲癇，膠質細胞活化導致的腦內炎癥反應是造成EP患者腦損傷，并進一步促使其發作的主要原因［1-2］。PI3K/Akt/GSK-3β是體內主要的存活信號通路，可調控氧化應激及炎癥反應，激活該通路，可抑制炎癥發生發展，減輕腦缺血再灌注損傷，并通過促使核因子E2相關因子活化，降低γ射線引起的神經毒性，由此推測，PI3K/Akt/GSK-3β信號可調控炎癥發生及進展，可能是影響EP發作的潛在作用靶點［3-4］。葛根素是我國傳統的藥食兩用植物葛根的主要藥效成分之一，具有心腦血管保護、抗氧化、抗炎、降糖、保肝等藥理活性，可激活PI3K/Akt/GSK-3β信號，抑制鉛誘導的氧化應激，發揮腦保護作用，還可通過抗氧化應激減輕乙醇導致的慢性腦損傷，并通過抑制過度自噬而改善缺血性中風所致的腦損傷，因而推測葛根素可能通過激活PI3K/Akt/GSK-3β通路減輕癲癇發作［5-7］。本文通過建立EP模型小鼠，基于PI3K/Akt/GSK-3β通路對葛根素減輕癲癇小鼠癥狀的作用機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級BALB/c小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，許可證號：SCXK（滬）-2009-0001，購自蘇州大學比較醫學中心，所有小鼠均在本院動物房中飼養，動物房環境達到清潔級，并保持安靜、通風良好，自由飲食、飲水，自然光照，溫度23℃，相對濕度45%，定時清洗、消毒鼠籠，隨時添加飼料、飲用水，適應性飼養1周。

1.1.2 主要試劑及儀器 葛根素注射液（商品規格：2 ml∶0.1 g，國藥準字：H20053731，湖北天圣康迪制藥有限公司）；LY294002（貨號HY-10108，美國MCE公司）；SOD檢測試劑盒（貨號S311，同仁化學研究所）；MDA檢測試劑盒［貨號JK-（a）-2197，上海晶抗生物工程有限公司］；小鼠IL-6及TNF-α ELISA試劑盒、小鼠ELISA試劑盒、兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK-3β及p-GSK-3β一抗、羊抗兔 二 抗（貨 號ab100772、ab100785、ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449、ab75745、ab75745、ab150077，美國Abcam公司）；RIPA裂解液、BCA試劑盒、HE染色試劑盒（貨號P0013K、P0011、C0105，上海碧云天公司）等；Morris水迷宮（型號XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司）；酶標儀（型號XElx800，美國Perkin Elmer公司）；切片機（型號CM3050S，德國Leica公司）；光學顯微鏡（型號SMZ745，日本尼康公司）；通用電泳儀（型號JY200C，上海楚柏實驗室設備有限公司）；蛋白轉移電泳槽（型號Tanon-186，北京中慧天誠科技有限公司）；凝膠成像儀（型號GIS-500，Miulab公司）等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組給藥 以35 mg/kg的劑量［8］腹腔注射戊四氮制備EP小鼠模型，隔天注射1次，共注射15次，然后觀察小鼠行為活動30 min判斷癲癇發作級別，參照Racine分級標準：面部出現陣攣為Ⅰ級；頸部肌肉出現痙攣并甩尾/節律性點頭為Ⅱ級；單側前肢出現抽搐為Ⅲ級；雙前肢出現抽搐為Ⅳ級；四肢出現抽搐，失去平衡，跳躍及跌倒等為Ⅴ級，如小鼠癲癇發作持續為Ⅳ級以上，表明模型制備成功，共建模53只，成功48只，隨機分為模型組、LY294002組、葛根素組、葛根素+LY294002組4組，每組12只，另取12只小鼠腹腔注射等劑量生理鹽水設為對照組。葛根素組、葛根素+LY294002組小鼠腹腔注射320 mg/kg［9］劑量的葛根素注射液，LY294002組、葛根素+LY294002組小鼠尾靜脈注射0.3 mg/kg［10］劑量的LY294002，對照組與模型組小鼠，以與LY294002組相同劑量的生理鹽水尾靜脈注射，同時腹腔注射與葛根素組等劑量的生理鹽水，每天1次，持續14 d。

1.2.2 小鼠癲癇發作檢測 給藥結束后24 h，觀察小鼠行為活動，記錄1 d之中小鼠癲癇發作次數、持續時間。

1.2.3 小鼠認知功能檢測及標本收集 以Morris水迷宮實驗檢測小鼠認知功能，參照文獻［11］及說明書中的步驟進行操作，使用平均逃避潛伏期及穿越原平臺位置次數作為小鼠認知功能的判斷標準。各組小鼠吸入乙醚麻醉后，眼眶取血1.5 ml，靜置15 min后，4℃離心20 min，收集上清液即獲得血清，儲存在-80℃冰箱中；斷頭處死后解剖，獲得大腦，剪碎后加入蛋白裂解液，勻漿制備為勻漿液，4℃離心20 min，收集上清液（蛋白樣品液），儲存在-80℃冰箱中。

1.2.4 小鼠腦組織SOD、MDA及血清IL-6、TNF-α水平檢測 將1.2.3中的血清、蛋白樣品液置于4℃冰箱中解凍，參照小鼠ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-6、TNF-α水平，取適量蛋白樣品液，參照SOD及MDA試劑盒說明書步驟檢測其中SOD、MDA水平，剩余進行Western blot。

1.2.5 Western blot檢測小鼠腦組織PI3K/Akt/GSK-3β通路相關蛋白表達 將1.2.4中剩余的蛋白樣品液，采用BCA試劑盒（具體步驟參照說明書）測定其中蛋白總濃度，然后將各組蛋白濃度調至相同，取相同體積的各組蛋白樣品液上樣進行電泳，分離蛋白后濕轉，轉移全部蛋白至PVDF膜上，置于5%脫脂奶粉中，于搖床上室溫封閉2 h，根據蛋白分子量截取目的蛋白條帶置于小盒中，各種蛋白做好標 記，加 入 兔 源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK-3β及p-GSK-3β一抗，于4℃冰箱中孵育過夜，TBST溶液漂洗后，以羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST溶液再次漂洗后，蛋白條帶以ECL顯色，然后以凝膠成像系統進行拍照，采用Quantity One軟件對圖像進行分析，得到各組蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS24.0軟件對數據進行統計分析，以±s表示計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠癲癇發作情況 與對照組相比，模型組小鼠癲癇發作次數增加，持續時間明顯延長（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組小鼠癲癇發作次數減少，持續時間縮短（P＜0.05）；LY294002組小鼠癲癇發作次數增加，持續時間延長（P＜0.05）。與LY29-4002組相比，葛根素+LY294002組小鼠癲癇發作次數減少，持續時間縮短（P＜0.05）。與葛根素組相比，葛根素+LY294002組小鼠癲癇發作次數增加，持續時間延長（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠癲癇發作情況（±s，n=12）Tab.1 Seizures of mice in each group（±s，n=12）

表1 各組小鼠癲癇發作情況（±s，n=12）Tab.1 Seizures of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with Puerarin group，3）P＜0.05；compared with LY294002 group，4）P＜0.05.

Groups Control group Model group Puerarin group LY294002 group Puerarin+LY294002 group Number of attacks 0.00±0.00 15.24±3.421）2.47±0.322）22.45±2.641）2）3）16.47±3.571）3）4）Duration（s）0.00±0.00 45.03±9.071）2.06±0.282）64.89±10.581）2）3）46.67±9.161）3）4）

2.2 各組小鼠認知功能 與對照組相比，模型組小鼠平均逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），穿越原平臺位置次數明顯減少（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組小鼠平均逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿越原平臺位置次數增加（P＜0.05）；LY294002組小鼠平均逃避潛伏期延長（P＜0.05），穿越原平臺位置次數減少（P＜0.05）。與LY294002組相比，葛根素+LY294002組小鼠平均逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿越原平臺位置次數增加（P＜0.05）。與葛根素組相比，葛根素+LY294002組小鼠平均逃避潛伏期延長（P＜0.05），穿越原平臺位置次數減少（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠認知功能（±s，n=12）Tab.2 Cognitive function of mice in each group（±s，n=12）

表2 各組小鼠認知功能（±s，n=12）Tab.2 Cognitive function of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with Puerarin group，3）P＜0.05；compared with LY294002 group，4）P＜0.05.

Groups Control group Model group Puerarin group LY294002 group Puerarin+LY294002 group Average escape latency（s）27.98±4.11 40.12±7.331）29.03±4.652）53.96±9.851）2）3）40.84±8.031）3）4）Times of crossing original platform 3.67±0.52 1.42±0.261）3.53±0.482）0.36±0.051）2）3）1.39±0.321）3）4）

2.3 各組小鼠腦組織MDA、SOD水平 與對照組相比，模型組小鼠腦組織MDA水平明顯升高（P＜0.05），SOD水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組小鼠腦組織MDA水平降低（P＜0.05），SOD水平升高（P＜0.05），LY294002組小鼠腦組織MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05）。與LY294002組相比，葛根素+LY294002組小鼠腦組織MDA水平降低（P＜0.05），SOD水平升高（P＜0.05）。與葛根素組相比，葛根素+LY294002組小鼠腦組織MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠腦組織MDA、SOD水平（±s，n=12）Tab.3 Levels of MDA and SOD in brain tissue of mice in each group（±s，n=12）

表3 各組小鼠腦組織MDA、SOD水平（±s，n=12）Tab.3 Levels of MDA and SOD in brain tissue of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with Puerarin group，3）P＜0.05；compared with LY294002 group，4）P＜0.05.

Groups Control group Model group Puerarin group LY294002 group Puerarin+LY294002 group SOD（U/mg）223.04±35.17 71.87±16.451）218.36±41.432）28.87±3.951）2）3）70.03±15.931）3）4）MDA（nmol/mg）2.06±0.53 4.58±1.031）2.15±0.512）6.05±1.431）2）3）4.63±1.051）3）4）

2.4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 與對照組相比，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組小鼠血清IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05），LY294002組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）。與LY294002組相比，葛根素+LY294002組小鼠血清IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05）。與葛根素組相比，葛根素+LY294002組小鼠血清IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平（±s，n=12）Tab.4 Serum levels of IL-6 and TNF-α in each group（±s，n=12）

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平（±s，n=12）Tab.4 Serum levels of IL-6 and TNF-α in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with Puerarin group，3）P＜0.05；compared with LY294002 group，4）P＜0.05.

Groups Control group Model group Puerarin group LY294002 group Puerarin+LY294002 group IL-6（pg/ml）35.02±2.23 79.96±9.471）35.87±2.342）101.38±16.121）2）3）80.65±13.861）3）4）TNF-α（pg/ml）38.01±2.47 84.23±5.241）38.69±2.412）112.06±18.571）2）3）84.94±5.781）3）4）

2.5 各組小鼠腦組織PI3K/Akt/GSK-3β通路相關蛋白表達 與對照組相比，模型組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β明 顯 降低（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β升高（P＜0.05）；LY294002組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β降低（P＜0.05）。與LY294002組相比，葛根素+LY294002組小鼠腦組織 中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β升高（P＜0.05）。與葛根素組相比，葛根素+LY294002組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β降低（P＜0.05），見圖1、表5。

圖1 各組小鼠腦組織中PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白免疫印跡檢測結果Fig.1 Western blot results of PI3K/Akt/GSK-3β pathway protein in brain tissue of mice in each group

表5 各組小鼠腦組織中PI3K/Akt/GSK-3β通路相關蛋白相對表達（±s，n=12）Tab.5 Relative expression of PI3K/Akt/GSK-3β pathway related proteins in brain tissues of mice in each group（±s，n=12）

表5 各組小鼠腦組織中PI3K/Akt/GSK-3β通路相關蛋白相對表達（±s，n=12）Tab.5 Relative expression of PI3K/Akt/GSK-3β pathway related proteins in brain tissues of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with the control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with Puerarin group，3）P＜0.05；compared with LY294002 group，4）P＜0.05.

Groups Control group Model group Puerarin group LY294002 group Puerarin+LY294002 group p-PI3K/PI3K 0.91±0.14 0.32±0.061）0.84±0.132）0.09±0.011）2）3）0.30±0.051）3）4）p-Akt/Akt 0.96±0.16 0.36±0.071）0.90±0.142）0.11±0.021）2）3）0.35±0.081）3）4）p-GSK-3β/GSK-3β 1.01±0.18 0.37±0.081）0.94±0.122）0.12±0.031）2）3）0.36±0.091）3）4）

3 討論

戊四氮作為一種GABAA受體拮抗劑，可使中樞神經系統興奮，并過度放電，在短時間內造成動物抽搐，出現癲癇癥狀，而腦神經過度的放電及癲癇持續發作，可引發呼吸障礙、腦組織缺血缺氧，激活膠質細胞，上調炎癥因子TNF-α、IL-6等異常表達，促使腦部氧化應激及炎癥反應發生并進展，導致腦神經細胞凋亡，損壞認知功能［11-14］。本文通過腹腔注射戊四氮制備EP小鼠模型，結果顯示，建模小鼠癲癇發作次數增加，發作持續時間及平均逃避潛伏期延長、腦組織MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平明顯升高，穿越原平臺位置次數減少，SOD水平明顯降低，表明戊四氮可引發氧化應激及炎癥發生，造成小鼠腦組織過度氧化，損壞認知功能，導致小鼠癲癇發作，揭示模型建立成功。

EP的臨床治療以苯二氮卓類藥物為主，可迅速減少癲癇發作，但EP患者大多需長期用藥，臨床常用的抗癲癇藥物存在易形成耐受性、長期療效差、毒副作用大等缺點，因此積極尋找更為安全有效的治療藥物至關重要［15］。葛根素提取自中藥葛根，可抗氧化、抗炎、抑制神經細胞凋亡，進而改善創傷性腦損傷小鼠神經功能缺損，發揮腦保護作用［16-17］。本研究結果顯示，EP模型小鼠經葛根素處理后，其癲癇發作次數減少，發作持續時間及平均逃避潛伏期縮短，腦組織MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平降低，穿越原平臺位置次數增加，SOD水平升高，表明葛根素可能通過抑制炎癥反應，降低氧化應激水平，減輕小鼠癲癇發作，改善其認知功能。

PI3K/Akt/GSK-3β信號可調控機體免疫炎癥、氧化應激、細胞存活、凋亡等生理病理過程，增強該信號中相關蛋白磷酸化水平，可激活該通路，進而抑制炎癥，下調凋亡蛋白表達，減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷［18］。研究發現，激活PI3K/Akt/GSK-3β通路可提高小鼠學習記憶能力，預防淀粉樣β誘導的記憶障礙［19］。另外，在HepG2細胞胰島素抵抗的研究中發現，葛根素可增強PI3K/Akt/GSK-3β信號轉導，由此推測，葛根素減輕EP癥狀的藥理機制可能與激活PI3K/Akt/GSK-3β通路有關［20］。本文結果顯示，EP小鼠腦組織中PI3K/Akt/GSK-3β通路相關蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β明顯降低，以PI3K抑制劑LY294002處理后，小鼠癲癇發作次數增加，發作持續時間及平均逃避潛伏期延長，穿越原平臺位置次數減少，表明PI3K/Akt/GSK-3β信號參與介導癲癇發作過程，抑制該通路可減輕癲癇癥狀。進一步研究發現，經葛根素和LY294002聯合處理后，EP小鼠癲癇發作次數減少，發作持續時間及平均逃避潛伏期縮短，腦組織MDA水平、血清IL-6及TNF-α水平比LY294002組小鼠降低，但高于葛根素組，穿越原平臺位置次數增加、SOD水平比LY294002組小鼠升高，但低于葛根素組，表明可減弱葛根素阻止炎癥發生、降低氧化應激水平、修復認知功能、減輕癲癇癥狀的作用可被LY294002逆轉，進一步提示葛根素可能通過激活PI3K/Akt/GSK-3β通路，抑制EP小鼠氧化應激和炎癥反應，減輕EP小鼠臨床癥狀。

綜上所述，葛根素可減輕EP小鼠腦部炎癥及氧化應激損傷，改善其認知功能，進而減輕EP小鼠臨床癥狀，為EP的臨床治療提供了新思路，激活PI3K/Akt/GSK-3β通路是其藥理機制之一。但本文只在整體層面進行了初步探討，關于PI3K/Akt/GSK-3β信號下游調控神經元凋亡的分子機制并未涉及，還存在一定不足，其更清楚完整的藥理機制還需后續深入研究。