lncRNA FAM83H-AS1通過抑制miR-383-3p表達調控食管癌細胞增殖、遷移、侵襲的分子機制研究①

李昱霖 謝 琳 鄧明佳 李 楊 易子寒

（昆明醫科大學第三附屬醫院，云南省腫瘤醫院消化腫瘤內科，昆明650000）

食管癌是我國發病率較的惡性腫瘤之一，其早期癥狀不明顯，多數患者確診時已屬中晚期，喪失了最佳手術治療時機，且部分患者對放化療不敏感，預后較差；隨著精準醫學的發展，分子靶向治療成為腫瘤治療的一個重要發展方向［1］。研究表明長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）廣泛參與了腫瘤的發生、進展、轉移等過程，在其中發揮了 關 鍵 作 用［2］。研 究 報 道lncRNA FAM83H反 義RNA 1（FAM83H antisense RNA 1，lncRNA FAM83HAS1）在胃癌中異常上調表達，在胃癌中起癌基因的作用［3］。lncRNA FAM83H-AS1可促進肺腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲并顯著抑制細胞凋亡［4］。上調lncRNA FAM83H-AS1通過Wnt/β-catenin途徑可促進肝細胞癌細胞增殖，遷移和侵襲［5］。miR-383-3p通過靶向MACC1抑制人惡性黑色素瘤中的細胞增殖，遷移和侵襲［6］。過表達miR-383通過下調5S rRNA的表達抑制了食管鱗癌細胞的增殖［7］。然而lncRNA FAM83H-AS1和miR-383-3p對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及機制目前還尚未可知。本實驗旨在研究FAM83H-AS1是否通過調控miR-383-3p影響食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床組織標本來源 選取本院2017年1月至2019年1月收治并經病理學檢驗為食管癌的患者35例。所有患者均具有完整臨床病理資料，手術前未進行過手術及放化療，經手術切除患者癌組織，距離癌組織邊緣2～5 cm處切除的作為癌旁組織，所有患者均知情且同意。

1.1.2 細胞及主要試劑與儀器 食管癌細胞株EC9706購自上海康朗生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自廈門慧嘉生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司。CO2孵育箱、Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司；FACSCantoⅡ流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司。熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組 食管癌細胞EC9706用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液在37℃、5%CO2條件下培養，2 d換液1次，取對數生長期細胞，將si-NC、si-FAM83H-AS1、pcDNA、pcDNA-FAM83H-AS1、miR-NC、miR-383-3p轉染至EC9706細胞中，記為si-NC組、si-FAM83H-AS1組、pcDNA組、pcDNAFAM83H-AS1組、miR-NC組、miR-383-3p組；將si-FAM83H-AS1分別與anti-miR-NC、anti-miR-383-3p共轉染至EC9706細胞中，記為si-FAM83H-AS1+anti-miR-NC組、si-FAM83H-AS1+anti-miR-383-3p組。

1.2.2 RT-qPCR檢 測FAM83H-AS1和miR-383-3p的表達水平 各組細胞培養24 h，提取總RNA，將RNA反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設3個重復，循環條件為95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個循環；60℃延 長5 min。相 對 表 達 量 用2-ΔΔCt法 計 算。FAM83H-AS1和miR-383-3p分別以GAPDH和U6為內參，FAM83H-AS1上游引物序列：5'-TAGGAAACGAGCGAGCCC-3'，下 游 引 物 序 列：5'-GCTTTGGGTCTCCCCTTCTT-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物序列：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；miR-383-3p上 游引物序列：5'-TGCGGTCCAGCATCAGTGAT-3'，下游引物序列：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6上游引物序列：5'-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列：5'-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖 在各組細胞培養至24 h、48 h、72 h時，每孔分別加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于培養箱中繼續孵育4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩反應10 min使沉淀溶解，用酶標儀于波長490 nm處檢測吸光度（OD）值。細胞增殖活性（%）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復3次。

1.2.4 Western blot法檢測CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達 提取細胞總蛋白并用BCA試劑盒進行蛋白定量。取50 μl蛋白樣品于10%SDSPAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜，用5%牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗4℃過夜，TBST洗膜3次；加入二抗室溫培養1 h，再用TBST洗滌3次，加入化學發光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值，蛋白表達水平為目的條帶和GAPDH條帶的比值。每個蛋白樣品設3個重復，實驗重復3次。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 細胞侵襲實 驗：Transwell小 室 上 室 加 入100 μl稀 釋 好 的Matrigel膠，添加后十字搖勻，在37℃培養箱放置40 min使之凝固。在Transwell小室上室加100 μl細胞懸液，下室加500 μl含血清培養液，37℃培養24 h，取出培養板，0.1%結晶紫染色30 min，PBS漂洗2遍，棉簽擦拭掉上層未穿過基底膜的細胞，光學顯微鏡（×200）下隨機選擇5個視野，拍照記錄并進行細胞計數。實驗重復3次。細胞遷移實驗：除不用Matrigel膠包被Transwell小室的上室，其余與細胞侵襲實驗操作相同。

1.2.6 熒光素酶報告實驗檢測FAM83H-AS1對miR-383-3p的靶向調控 構建含有miR-383-3p結合位點的FAM83H-AS1野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-FAM83H-AS1和MUT-FAM83H-AS1，將WT-FAM83H-AS1和MUT-FAM83H-AS1分 別 與miR-NC和miR-383-3p共轉染至細胞EC9706中。按照說明書檢測熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，計量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA FAM83H-AS1和miR-383-3p在食管癌組織中的表達 與癌旁組織相比，食管癌組織中FAM83H-AS1表達水平顯著升高，miR-383-3p表達水平顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 lncRNA FAM83H-AS1和miR-383-3p在食管癌組織中的表達（±s，n=9）Tab.1 Expression of lncRNA FAM83H-AS1 and miR-383-3p in esophageal cancer tissues（±s，n=9）

表1 lncRNA FAM83H-AS1和miR-383-3p在食管癌組織中的表達（±s，n=9）Tab.1 Expression of lncRNA FAM83H-AS1 and miR-383-3p in esophageal cancer tissues（±s，n=9）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P＜0.05.

Groups Adjacent tissues Esophageal cancer tissues t P FAM83H-AS1 1.00±0.06 2.95±0.281）40.287 0.000 miR-383-3p 1.02±0.07 0.61±0.061）26.309 0.000

2.2 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖的影響 與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組食管癌EC9706細胞中FAM83H-AS1表達水平顯著降低，細胞活性顯著降低，CyclinD1表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高（P＜0.05），見表2、圖1。

表2 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.2 Inhibitory effect of lncRNA FAM83H-AS1 on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 cells（±s，n=9）

表2 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.2 Inhibitory effect of lncRNA FAM83H-AS1 on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-FAM83H-AS1 t P FAM83H-AS1 1.01±0.07 0.49±0.051）18.135 0.000 OD value（490 nm）24 h 0.42±0.04 0.36±0.031）3.600 0.002 48 h 0.73±0.07 0.47±0.041）9.675 0.000 72 h 1.13±0.09 0.61±0.061）14.422 0.000 CyclinD1 protein 0.57±0.05 0.22±0.021）19.498 0.000 p21 protein 0.28±0.03 0.68±0.061）17.889 0.000

圖1 增殖相關蛋白的表達Fig.1 Expression of proliferation-related proteins

2.3 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞遷移侵襲的影響 與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組食管癌EC9706細胞遷移、侵襲數顯著降低，MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞遷移侵襲的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibition of lncRNA FAM83H-AS1 expression on migration and invasion of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

表3 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞遷移侵襲的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibition of lncRNA FAM83H-AS1 expression on migration and invasion of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-FAM83HAS1 t P Migration cell number 105.36±10.22 51.36±5.111）14.178 0.000 Invasive cell number 91.36±9.14 42.65±4.381）14.418 0.000 MMP-2 protein 0.74±0.07 0.30±0.031）17.330 0.000 MMP-9 protein 0.64±0.06 0.24±0.031）17.889 0.000

圖2 抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞遷移侵襲的影響Fig.2 Effect of inhibiting expression of lncRNA FAM83HAS1 on migration and invasion of esophageal cancer EC9706 cells

2.4 lncRNA FAM83H-AS1靶向調控miR-383-3p的表達LncBase Predicted v.2軟件預測顯示FAM83HAS1與miR-383-3p存在結合位點（圖3）。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組相比，miR-383-3p組中轉染野生型表達載體WT-FAM83H-AS1的細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而轉染突變型表達載體MUT-FAM83H-AS1的細胞熒光素酶活性無顯著差異（表4）。與pcDNA組相比，pcDNA-FAM83HAS1組miR-383-3p表達水平顯著降低（P＜0.05），與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組miR-383-3p表達水平顯著升高（P＜0.05），見表5。

表5 lncRNA FAM83H-AS1調控miR-383-3p的表達（±s，n=9）Tab.5 lncRNA FAM83H-AS1 regulates miR-383-3p expression（±s，n=9）

表5 lncRNA FAM83H-AS1調控miR-383-3p的表達（±s，n=9）Tab.5 lncRNA FAM83H-AS1 regulates miR-383-3p expression（±s，n=9）

Groups pcDNA pcDNA-FAM83H-AS1 si-NC si-FAM83H-AS1 F P miR-383-3p 1.00±0.08 0.61±0.061）0.99±0.07 2.74±0.262）397.222 0.000

圖3 FAM83H-AS1的序列中含有與miR-383-3p互補的核苷酸序列Fig.3 Sequence of FAM83H-AS1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-383-3p

表4 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiments（±s，n=9）

表4 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiments（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-383-3p t P WT-FAM83H-AS1 1.04±0.07 0.55±0.051）17.088 0.000 MUT-FAM83H-AS1 1.02±0.06 1.01±0.09 0.277 0.785

2.5 miR-383-3p過表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-383-3p組食管癌EC9706細胞中miR-383-3p表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，細胞遷移、侵襲數顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖4、表6。

圖4 miR-383-3p過表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的影響Fig.4 Effect of miR-383-3p overexpression on proliferation，migration and invasion of esophageal cancer EC9706 cells

表6 miR-383-3p過表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的影響（±s，n=9）Tab.6 Effects of miR-383-3p overexpression on proliferation and migration of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

表6 miR-383-3p過表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的影響（±s，n=9）Tab.6 Effects of miR-383-3p overexpression on proliferation and migration of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-383-3p t P miR-383-3p 1.01±0.07 3.05±0.291）20.514 0.000 OD value（490 nm）24 h 0.41±0.04 0.39±0.03 1.200 0.248 48 h 0.76±0.07 0.53±0.051）8.021 0.000 72 h 1.18±0.11 0.69±0.061）11.732 0.000 Migration cell number 102.36±10.33 62.58±6.331）9.850 0.000 Invasive cell number 94.87±9.49 53.66±5.371）11.338 0.000 CyclinD1 protein 0.59±0.05 0.29±0.031）15.435 0.000 p21 protein 0.27±0.03 0.63±0.061）16.100 0.000 MMP-2 protein 0.75±0.07 0.34±0.031）16.151 0.000 MMP-9 protein 0.66±0.06 0.31±0.031）15.652 0.000

2.6 干擾miR-383-3p表達逆轉了抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的作用 與si-FAM83H-AS1+anti-miR-NC組相比，si-FAM83H-AS1+anti-miR-383-3p組食管癌EC9706細胞中miR-383-3p表達水平顯著降低，細胞活性顯著升高，細胞遷移、侵襲數顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著升高，p21表達水平顯著降低（P＜0.05），見表7、圖5。

表7 干擾miR-383-3p表達逆轉了抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的作用（±s，n=9）Tab.7 Interference with miR-383-3p expression reversed effect of inhibiting lncRNA FAM83H-AS1 expression on proliferation and migration of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

表7 干擾miR-383-3p表達逆轉了抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的作用（±s，n=9）Tab.7 Interference with miR-383-3p expression reversed effect of inhibiting lncRNA FAM83H-AS1 expression on proliferation and migration of esophageal cancer EC9706 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05；compared with si-FAM83H-AS1+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

Groups si-NC si-FAM83H-AS1 si-FAM83H-AS1+anti-miR-NC si-FAM83H-AS1+anti-miR-383-3p F P miR-383-3p 1.02±0.08 2.96±0.291）2.93±0.28 1.51±0.152）128.082 0.000 OD value（490 nm）24 h 0.43±0.04 0.35±0.041）0.34±0.03 0.41±0.042）11.158 0.000 48 h 0.75±0.07 0.49±0.041）0.46±0.04 0.64±0.062）56.308 0.000 72 h 1.16±0.11 0.63±0.061）0.59±0.05 0.93±0.082）105.598 0.000 Migration cell number 106.33±9.87 54.22±5.411）52.69±5.22 89.65±8.222）115.050 0.000 Invasive cell number 96.33±9.57 45.21±4.511）43.69±4.33 88.24±8.742）134.573 0.000 CyclinD1 protein 0.58±0.05 0.23±0.021）0.21±0.02 0.49±0.042）253.408 0.000 p21 protein 0.29±0.03 0.67±0.061）0.69±0.06 0.38±0.032）164.367 0.000 MMP-2 protein 0.76±0.07 0.31±0.031）0.29±0.03 0.65±0.062）198.379 0.000 MMP-9 protein 0.63±0.06 0.26±0.031）0.24±0.03 0.52±0.052）169.937 0.000

圖5 干擾miR-383-3p表達逆轉了抑制lncRNA FAM83HAS1表達對食管癌EC9706細胞增殖和遷移侵襲的作用Fig.5 Interfering with expression of miR-383-3p reversed effect of inhibiting expression of lncRNA FAM83HAS1 on proliferation，migration and invasion of esophageal cancer EC9706 cells

3 討論

我國食管癌的發病率及病死率較高，研究食管癌的發病機制，尋找新的靶向治療是目前的研究熱點［8］。lncRNA是生物體內重要的調控分子，其異常表達與腫瘤的發生發展密切相關［9］。研究報道FAM83H-AS1在膀胱癌組織和膀胱癌細胞系中高表達，其高表達與晚期臨床階段以及肌瘤浸潤的存在有關，是膀胱癌患者總體生存的獨立不良預后因素；沉默FAM83H-AS1可抑制細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導G0/G1期細胞周期停滯［10］。FAM83HAS1在神經膠質瘤組織和細胞系中上調表達，高水平的FAM83H-AS1與神經膠質瘤的預后不良有關；沉默FAM83H-AS1可以抑制神經膠質瘤細胞增殖［11］。下調FAM83H-AS1通過抑制Notch信號通路從而抑制結直腸癌細胞增殖［12］。以上研究結果表明FAM83H-AS1參與多種腫瘤的發生發展，且發揮促癌作用。本實驗結果顯示，食管癌組織中FAM83H-AS1表達水平升高，抑制FAM83H-AS1表達，細胞活性顯著降低，細胞遷移、侵襲數顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高。說明抑制FAM83H-AS1表達可抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。

研究表明miRNA不僅參與調節機體的各項基礎生命活動，還參與腫瘤的發生、發展和治療，miRNA為腫瘤的基礎研究和臨床診斷及治療帶來了新的啟示［13］。研究發現miR-383-3p通過抑制炎癥小體信號通路的激活來預防高半胱氨酸誘導的大鼠冠狀動脈內皮細胞凋亡和炎癥損傷［14］。miR-338-3p在甲狀腺癌組織和細胞系中下調表達，且與甲狀腺癌的臨床分期和淋巴結轉移密切相關；miR-338-3p過表達在體外抑制了甲狀腺癌細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲，并抑制了腫瘤發生［15］。敲低HOXC13-AS通過 調 節miR-383-3p/HMGA2軸 抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲［16］。本實驗結果顯示，食管癌組織中miR-383-3p低表達；過表達miR-383-3p，細胞活性顯著降低，細胞遷移、侵襲數顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高。說明過表達miR-383-3p可抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。且本實驗還發現FAM83H-AS1靶向調控miR-383-3p，干擾miR-383-3p表達逆轉了抑制lncRNA FAM83H-AS1表達對食管癌EC9706細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。提示，lncRNA FAM83H-AS1可能通過調控miR-383-3p表達影響食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，抑制lncRNA FAM83H-AS1表達可能通過上調miR-383-3p表達抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。