咳嗽變異性哮喘患者血清中sPLA2-X含量與CysLT、iNOS、IL-33及FeNO的關系研究①

張翊玲 路 蘋 鄭夢凝 姚紅梅（貴州省人民醫院呼吸與危重癥醫學科，貴陽550002）

咳嗽是機體重要的防御性反射，有利于清除呼吸道分泌物和有害因子，但頻繁劇烈的咳嗽會對患者造成各方面的嚴重影響。在呼吸?？崎T診，咳嗽是最常見的求診癥狀。在社區人群中，慢性咳嗽患病率大約為10%，在國內呼吸?？崎T診中，慢性咳嗽患者可占三分之一甚至更高。臨床常根據X線胸片檢查有無異常，并將慢性咳嗽分為兩類：一類為X線胸片有明確病變者，如肺炎、肺結核、支氣管肺癌等；另一類為X線胸片無明顯異常，以咳嗽為主要或唯一癥狀，即傳統概念的慢性咳嗽。引起慢性咳嗽的病因眾多，常見病因包括：咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma,CVA）、上氣道咳嗽綜合征（upper airway cough syndrome,UACS）、嗜酸粒細胞性支氣管炎（eosinophilic bronchitis,EB）、胃食管反流性咳嗽(gestroesophageal refluxrelated chronic cough,GERC)變應性咳嗽（atopic cough,AC），上述病因約占慢性咳嗽病因的絕大多數。而CVA占比最高。CVA是一種特殊的哮喘，咳嗽是其唯一或主要臨床表現，無明顯喘息、氣促等癥狀或體征，但有氣道高反應性。臨床表現主要表現為刺激性干咳，通?？人员容^劇烈，夜間咳嗽為其重要特征，感冒、冷空氣、灰塵、油煙等誘發或加重咳嗽［1-5］。

sPLA2-X（分泌型磷脂酶A2-X）是在哺乳動物細胞中調節類二十烷酸最為關鍵的因素，sPLA2-X能夠促進致病性炎癥過程。研究發現支氣管哮喘發病與sPLA2-X密切相關，在哺乳動物細胞中，sPLA2-X是調節花生酸類物最為關鍵的因素，sPLA2-X具有獨立促炎催化功能以及具有介導花生酸類物的非酶機制，同時又具有強有力的水解活性。其主要生理功能為調節CysLTs（半胱氨酰白三烯）、AA、PG等類二十烷酸的生物合成從而實現對支氣管哮喘發展的促進作用，CysLTs在哮喘氣道中高度表達，能強烈誘導氣道平滑肌的收縮，哮喘患者氣道sPLA2-X活性升高增加CysLTs合成［6-10］。動物試驗也表明缺乏sPLA2-X會減少CysLTs的生成。支氣管哮喘患者血清中sPLA2-X及CysLTs與FeNO、iNOS等相關研究尚未報道，作為支氣管哮喘的特殊類型，CVA患者是否與sPLA2-X及其重要產物CysLTs有一定的關聯，且sPLA2-X是否對CVA有相應的影響，相關文獻未見報道。

本研究旨在評估咳嗽變異性哮喘（CVA）患者血清中sPLA2-X、CysLTs、IL-33、IL-17、iNOS（誘生型一氧化氮合酶）及血清總IgE表達情況，還有肺功能和FeNO（呼出氣一氧化氮）的情況。并探討CVA患者血清中sPLA2-X含量是否與血清中IL-33、IL-17、iNOS含量及FeNO存在相關性，進一步研究sPLA2-X對CVA的影響，為咳嗽變異性哮喘的發病機制及治療提供新的思路與策略，為該類的臨床研究提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例納入和排除標準 選取貴州省人民醫院呼吸與危重癥醫學科2018年6月至2019年11月門診確診的CVA患者為研究對象及同期在我院健康體檢中心體檢的健康患者為對照組，分為CVA治療前組（41例）和健康對照組23例?？人宰儺愋韵颊咧委熐敖M（即門診首次確診，未規范治療）。經規范治療3月后為CVA治療后組（41例）［即規范吸入沙美特羅氟替卡松粉劑（50 μg∕250 μg），1次1吸，每天2次，吸后清水漱口；口服用孟魯司特鈉咀嚼片10 mg，每晚1次］。經規范治療3月后門診復查肺功能、FeNO及血標本。診斷CVA依據：慢性咳嗽＞8周，常伴有夜間刺激性咳嗽；支氣管激發試驗陽性或PEF變異率≥20%，或支氣管舒張試驗陽性；經抗哮喘治療有效。入選患者訴主要癥狀或首發癥狀為咳嗽，但入選患者病程不一，部分患者訴病程中出現過胸悶、氣促。但首次在門診確診時查體未聞及哮鳴音。排除標準：慢性咳嗽的一些其他病因還包括慢性支氣管炎、支氣管擴張癥、氣管-支氣管結核、血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）等藥物性咳嗽、支氣管肺癌和心理性咳嗽等以及合并心腦血管系統、消化系統、泌尿系統、內分泌系統等疾病。咳嗽變異性哮喘治療前組經孟魯司特10 mg口服（1次∕d）及沙美特羅氟替卡松（50 μg∕250 μg）每日兩次吸入，規范化治療3月后于患者門診再次抽血及復查肺功能、FeNO。本研究中的檢測標本均為外周靜脈血，咳嗽變異性哮喘患者治療3月后門診常規行肺功能及FeNO檢查，故依從性較好，均已向患者告知并獲知情同意。

1.1.2 分組 將研究對象分為健康對照組23例、CVA（咳嗽變異性哮喘）治療前組41例、CVA（咳嗽變異性哮喘）治療后組41例（原本有53例咳嗽變異性哮喘患者符合納入標準，因部分患者用藥不規律及部分患者失訪，故最終納入本研究的CVA患者為41例）。

健康對照組：選取貴州省人民醫院體檢中心健康志愿者23例作為健康對照組。無咳嗽表現，既往體健，無呼吸系統相關疾病如支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病及其他慢性呼吸道疾病史；近1個月無呼吸系統等感染病史；查體均未見異常；血常規、尿常規、腹部超聲、胸片均正常。

健康對照組與CVA組患者，年齡、性別、身高、體重、BMI、吸煙方面等一般資料比較，兩組間差異無統計學意義（P＞0.05，見表1）。

表1 兩組一般資料對比（±s）Tab.1 Comparison of general data between two groups（±s）

表1 兩組一般資料對比（±s）Tab.1 Comparison of general data between two groups（±s）

Groups Healthy control group CVA（cough variant asthma）group P n 23 41 Gender（male∕female）11∕12 22∕19＞0.05 Age（years）45.76±16.84 47.59±17.09＞0.05 Smoking（Yes∕No）7∕16 13∕28＞0.05 Height（cm）167.3±13.5 169.7±12.8＞0.05 BMI（kg∕m2）24.8±7.9 25.3±7.2＞0.05

1.2 方法 選取健康對照組體檢者、確診當天咳嗽變異性哮喘CVA患者與經孟魯司特及沙美特羅氟替卡松規范化治療3個月后的復查患者。抽靜脈血5 ml，室溫下靜置1 h，3 000 r∕min離心10 min，得到上清液，血清樣本保存在2℃～8℃之間，其余在-80℃下冷凍保存。ELISA方法檢測血清sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-17、IL-33、總IgE含量。肺功能檢測儀檢測常規的肺功能指標如肺活量、肺總量、用力肺活量、殘氣量、最大呼氣中期流速等，同時做支氣管激發試驗。取外周血上清液采用雙抗體夾心ELISA試劑盒（sPLA2-X、CysLT試劑購買于R&D公司；iNOS、IL-17、IL-33試劑購買于BD公司；總IgE試劑購于eBioscience公司）檢測血清中總IgE、sPLA2-X、CysLTs、IL-17、IL-33及iNOS的表達水平。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。450 nm處酶標儀讀取吸光度（A）值，制作相應的標準曲線，根據標準曲線，定量分析血清中總IgE、sPLA2-X、CysLTs、iNOS、IL-17、IL-33的表達水平［11］。觀察指標：記錄患者血清中sPLA2-X、CysLTs、IL-17、IL-33、iNOS以及FeNO、肺功能、血清總IgE等。

1.3 統計學分析 采用SPSS18.0軟件對數據進行整理分析，所有數據均經過正態分布和方差齊性檢驗。正態分布的計量資料以±s表示，兩組間計量資料比較采用t檢驗或配對t檢驗，非正態分布數據采用中位數（四分位距）表示。計數資料采用卡方檢驗；非正態分布采用Spearman進行相關性分析。采用GraphPad Prism6作圖，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CVA患者治療前后肺功能FVC pred%、FEV1 pred%、FEV1∕FVC（%）、MMEF pred%及血嗜酸性粒細胞絕對數、血清總IgE的比較 結果如表2所示：與CVA患者治療前比較，CVA患者經治療后其肺功能FVC pred%，FEV1 pred%，FEV1∕FVC（%），MMEF pred%均顯著升高，差異具有統計學意義（P＞0.05）。CVA患者屬于哮喘中的特殊類型，部分病程較長的患者已出現胸悶、氣促等表現，故肺功能在治療前FVC pred%、FEV1 pred%、FEV1∕FVC（%）、MMEF pred%有所下降，經治療后FVC pred%，FEV1 pred%，FEV1∕FVC（%），MMEF pred%得到改善，該結果與臨床實際情況相一致；外周血嗜酸性粒細胞絕對數無論在CVA治療前還是治療，均無顯著升高，兩組間差異不顯著，無統計學意義（P＞0.05）；與CVA患者治療前比較，CVA患者經治療后血清中總IgE顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 CVA患者治療前后肺功能及血嗜酸性粒細胞絕對數、血清總IgE的前后變化（±s）Tab.2 Changes of lung function，absolute number of blood eosinophils and total serum IgE in CVA pa?tients before and after treatment（±s）

表2 CVA患者治療前后肺功能及血嗜酸性粒細胞絕對數、血清總IgE的前后變化（±s）Tab.2 Changes of lung function，absolute number of blood eosinophils and total serum IgE in CVA pa?tients before and after treatment（±s）

Parameters Lung function FVC pred（%）FEV1 pred（%）FEV1∕FVC（%）MMEF pred%Eosinophil absolute count（×106）Normal range（20×106～520×106）median（IQR）Total IgE in serum（U∕ml）Normal range（0～100）（U∕ml）median（IQR）CVA group before treatment（n=41）73.2±12.3 72.2±14.8 75.7±13.7 69.4±19.5 320（105～480）226（138～364）CVA group after treatment（n=41）84.6±11.5 87.9±10.2 85.7±8.6 80.3±22.1 295（87～436）85（70～162）P value＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＞0.05＜0.05

2.2 CVA患者治療前后及健康對照組血清中sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-17、IL-33以及CVA患者治療前后FeNO變化情況（圖1）。

2.2.1 CVA患者治療前后及健康對照組患者血清中sPLA2-X表達情況 結果如圖1A所示：與健康對照組比較，CVA治療前患者血清中的sPLA2-X表達顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與CVA治療前組比較，CVA治療后組血清中sPLA2-X顯著降低，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。

2.2.2 CVA患者治療前后及健康對照組患者血清中CysLT表達情況 結果如圖1B所示：與健康對照組比較，CVA治療前患者血清中的CysLT表達顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與CVA治療前組比較，CVA治療后組血清中CysLT顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

2.2.3 CVA患者治療前后FeNO變化情況 結果如圖1C所示：與CVA治療前組比較，CVA治療后組FeNO顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。CVA是支氣管哮喘中的特殊類型，納入的患者均為門診患者以慢性咳嗽為首發癥狀，并于門診第一次確診，且首發癥狀以咳嗽為主，但具體病程不同，因入選的患者病程不一，就診時部分患者已出現胸悶、氣促等表現，嚴格意義上講，其部分患者已接近典型的過敏性哮喘。因此出現FeNO值較高。

圖1 CVA患者治療前后及健康對照組血清中sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-17、IL-33表達情況以及CVA患者治療前后FeNO變化情況Fig.1 Expression of sPLA2-X，CysLT，iNOS，IL-17，and IL-33 in serum of CVA patients before and af?ter treatment and healthy control group and chang?es of FeNO in CVA patients before and after treat?ment

2.2.4 CVA患者治療前后及健康對照組患者血清中IL-17表達情況 結果如圖1D所示：與健康對照組比較，CVA治療前患者血清中的IL-17表達無明顯升高，差異無統計學意義（P＞0.05）。與CVA治療前組比較，CVA治療后組血清中IL-17無明顯降低，差異無統計學意義（P＜0.05）。

2.2.5 CVA患者治療前后及健康對照組患者血清中IL-33表達情況 結果如圖1E所示：與健康對照組比較，CVA治療前患者血清中的IL-33表達顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與CVA治療前組比較，CVA治療后組血清中IL-33顯著降低，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。

2.2.6 CVA患者治療前后及健康對照組患者血清中iNOS表達情況 結果如圖1F所示：與健康對照組比較，CVA治療前患者血清中的iNOS表達顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與CVA治療前組比較，CVA治療后組血清中iNOS顯著降低，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 CVA治療前組血清中sPLA2-X含量與CysLT、FeNO、iNOS、IL-17、IL-33相關性 如圖2所示：在CVA治療前組，血清中sPLA2-X含量與CysLT、FeNO、iNOS、IL-33呈正相關（分別是r=0.854 7、0.622 9、0.644 9、0.778 9，P＜0.001，差異具有統計學意義），IL-17與血清中sPLA2-X含量無相關性（r=0.058 5，P=0.127 6，差異無統計學意義）。

圖2 在CVA治療前組，血清中sPLA2-X含量與CysLT、FeNO、iNOS、IL-17、IL-33相關性研究Fig.2 Correlation between sPLA2-X and CysLT，FeNO，iNOS，IL-17 and IL-33 in serum of CVA group be?fore treatment

3 討論

慢性咳嗽是呼吸系統疾病常見癥狀，引起慢性咳嗽的病因很多，常見病因為咳嗽變異性哮喘、上氣道咳嗽綜合征、嗜酸性粒細胞支氣管炎、胃食管反流性咳嗽及變異性咳嗽。上述病因約占慢性咳嗽病因的絕大多數，而CVA占比最高。CVA是一種特殊的哮喘，咳嗽是其唯一或主要臨床表現，無明顯喘息、氣促等癥狀或體征，但有氣道高反應性。研究發現支氣管哮喘發病與sPLA2-X密切相關，在哺乳動物細胞中，sPLA2-X是調節花生酸類物最為關鍵的因素，sPLA2-X能夠促進炎癥過程。sPLA2-X具有獨立的促炎催化功能，介導花生酸類物的非酶機制，同時又具有強有力的水解活性。其主要生理功能為調節CysLT、AA等類二十烷酸的生物合成從而實現對支氣管哮喘發展的促進作用，CysLT在哮喘氣道中高度表達，能強烈誘導氣道平滑肌的收縮［6-10］。

結合本研究結果所示，與健康對照組相比，咳嗽變異性哮喘患者治療前血清中sPLA2-X及其CysLT、iNOS、IL-33的表達明顯升高，且差異具有顯著統計學意義?？人宰儺愋韵瓰橹夤芟奶厥忸愋?，具有支氣管哮喘的共性，研究表明支氣管哮喘與sPLA2-X及CysLT、IL-33密切相關，本研究結果顯示CVA患者治療前血清中的sPLA2-X及CysLT顯著升高，經規范化治療后，CVA患者治療后血清中的sPLA2-X及CysLT顯著降低，該結果顯示sPLA2-X及CysLT與咳嗽變異性哮喘存在重要的關聯。研究表明，IL-33∕ST2通路與哮喘的發展有密切關聯。IL-33作為Th2型細胞因子的重要誘生因素已被公認。其介導的IL-33∕ST2通路可廣泛作用于Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、氣道上皮細胞等，維持或加劇過敏性炎癥反應。在有過敏原的情況下，IL-33能提高過敏原刺激后的Th2型細胞因子IL-5∕IL-13的分泌。IL-33能誘導嗜酸性粒細胞的超氧陰離子生成以及促使嗜酸性粒細胞脫粒釋放IL-5，同時IL-33具有調節嗜酸性粒細胞黏附的作用及提高嗜酸性粒細胞的存活力。IL-33在哮喘發生發展中發揮重要的作用［12-16］。本研究中，CVA治療前組患者血清中IL-33表達顯著升高，經規范化治療后，CVA治療后組患者血清中IL-33表達顯著降低，該結果表明CVA可能具有支氣管哮喘的特點，與IL-33有重要的關聯。且在CVA治療前組血清中sPLA2-X表達與CysLT、IL-33呈正相關，該結果說明sPLA2-X、CysLT、IL-33與咳嗽變異性哮喘存在重要的關聯。

FeNO本質是描述氣道炎癥的生物標記物，主要由炎癥細胞誘導iNOS持續表達［17-21］。FeNO在臨床上主要用于哮喘復發、評估依從性和指導治療。FeNO與嗜酸性粒細胞炎癥密切相關，高水平的Fe-NO可作為吸入性糖皮質激素（inhaled corticosteroids,ICS）治療反應的敏感指標，而過敏患者FeNO升高是哮喘急性發作的獨立危險因素。FeNO作為無創檢測，能夠反映氣道炎癥。本研究結果顯示，CVA治療前組FeNO明顯高于治療后組，咳嗽變異性哮喘多與嗜酸性粒細胞密切相關，對糖皮質激素治療敏感，在本研究結果中，FeNO在治療前組顯著升高，與其他CVA相關研究相一致。FeNO與炎癥細胞誘導iNOS表達呈正相關。誘生型一氧化氮合酶（iNOS）的激活與炎癥介質、細胞因子、感染、缺氧等刺激因素密切相關。iNOS過度激活、引起大量的NO產生是機體損害的重要因素之一，iNOS表達水平與機體炎癥反應的嚴重程度呈正相關。正常情況下，iNOS不產生NO；在缺血、缺氧、內毒素等激活條件下誘導iNOS mRNA的表達，合成iNOS，從而產生過量的NO可對缺血組織造成損害。FeNO與iNOS呈正相關，因此FeNO可間接反映氣道炎癥的嚴重程度［20-22］。本研究結果顯示，CVA治療前組血清中iNOS表達顯著升高，經規范治療后iNOS在CVA治療后組血清中表達顯著降低，該結果與相關研究相一致，均提示FeNO與iNOS呈正相關。同時，本研究血清中sPLA2-X含量與FeNO、iNOS呈正相關，該結果表明sPLA2-X、FeNO、iNOS均與咳嗽變異性哮喘存在重要關聯。

在CVA治療前組及CVA治療后組，血清中IL-17無顯著變化。在CVA治療前組，IL-17與血清中sPLA2-X含量無相關性。支氣管哮喘發病機制錯綜復雜，除Th2細胞外還有其他細胞參與調節哮喘的發生和發展。相關研究表明重癥哮喘、難治性哮喘或激素抵抗型哮喘多與IL-17及中性粒細胞相關，糖皮質激素治療效果差。這表明重癥哮喘、難治性哮喘或激素抵抗型哮喘與產生IL-17的Th17細胞及中性粒細胞密切相關，而CVA是以嗜酸性粒細胞為主的Th2細胞型哮喘，而非Th17細胞及中性粒細胞型哮喘。IL-17可以通過促進釋放前炎癥細胞因子來放大炎癥反應。IL-17能有效地介導中性粒細胞動員的興奮過程，從而有效介導組織的炎癥反應［23-26］。CVA糖皮質激素治療效果好，CVA主要與嗜酸性粒細胞相關，相關研究尚未表明CVA與IL-17及中性粒細胞相關。本研究結果顯示CVA治療前組及CVA治療后組，血清中IL-17無顯著變化。在CVA治療前組，IL-17與血清中sPLA2-X含量無相關性，與相關的研究一致。

本研究表明CVA患者為支氣管哮喘特殊類型，其血清中sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-33及總IgE顯著升高，且FeNO顯著升高。經治療后血清中sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-33顯著降低，血清中sPLA2-X含量與CysLT、iNOS、IL-33及FeNO呈正相關。結果表明CVA與sPLA2-X、CysLT、iNOS、IL-33及FeNO顯著相關，為CVA的發病機制及治療提供新的思路與策略，為該類的臨床研究提供一定的理論依據。