VEGF調控肥胖小鼠棕色脂肪組織炎癥反應相關基因表達及通路的研究①

李思琦 蘆小單 王國慶 高鴻霞（北華大學醫學技術學院，吉林132013）

肥胖是一種低級別的慢性炎癥性疾病，與2型糖尿病和胰島素抵抗等代謝紊亂相關［1］。目前對肥胖的研究多集中在脂肪組織，而脂肪組織又分為白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）和棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）。白色脂肪細胞的主要作用是儲存能量，而棕色脂肪細胞參與調節能量消耗和快速產熱。近年研究發現，BAT通過減少脂肪炎癥，能夠抵抗高脂肪飲食（high fat diet，HFD）誘導的肥胖并維持全身葡萄糖穩態［2］。血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA/VEGF）參與調控脂肪組織能量代謝，抑制VEGF表 達 的小鼠，能 夠抵抗HFD誘導的肥 胖［3］。但VEGF調控BAT能量代謝的機制有待進一步研究。

RNA-Seq是近年發展起來的一種基于序列分析的檢測整體轉錄組表達的方法。同早期的技術方法相比，如微列陣，RNA-Seq具有更廣泛的動態范圍和更高的檢測低豐度轉錄本的靈敏度，允許檢測更多的差異表達基因和更高的折疊變化［4］。本研究利用VEGF可逆抑制轉基因小鼠，通過RNA-Seq建立了BAT轉錄組圖譜，并篩選出VEGF正常表達組BAT和VEGF抑制表達組BAT中差異表達的基因，對其進行功能注釋（GO）和信號通路（KEGG）富集分析，以探究VEGF調控BAT炎癥反應的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物文獻［3］報道過四環素調節VEGF可逆抑制小鼠模型，小鼠飼養于東北師范大學轉基因動物實驗中心。溫度（22±2）℃，濕度40%～70%，12 h/12 h光暗循環，可自由獲取食物和水。所有程序均獲得東北師范大學動物護理與使用委員會批準。將小鼠分為VEGF正常表達組（dox+組）和VEGF抑制表達組（dox-組），每組6～10只，所有小鼠選用基因型：VEGFtetO/tetO：bAKtg，小鼠出生后喂食普通飼料4周后換成高脂飼料喂養，持續8周。

1.1.2 試劑TRIzol、化學發光檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；iScript RT-PCR、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自美國Bio-Rad公司；MinuteTM動物組織總蛋白提取試劑盒購自北京Invent生物技術有限公司；VEGF抗體購自英國Abcam公司；β-actin購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）以TRIzol法從小鼠肩胛BAT中提取總RNA。按照說明書使用iScript RT-PCR試劑盒對純化的1μg RNA進行逆轉錄。依據SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書取2 μl cDNA進行實時熒光定量反應。RT-PCR分析在7500fast real-time PCR系統上進行，PCR條件為：98℃5 min，98℃30 s，72℃1 min，40個循環。在實驗中以18s為內參照，用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.2 Western blot取小鼠肩胛處BAT，按照MinuteTM動物組織總蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白。酶標儀測定蛋白濃度后，將20μg/孔的蛋白質樣品裝入10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中，PVDF膜濕轉2 h，隨后用溶于TBST中的5%脫脂牛奶的封閉1 h。VEGF、β-actin在搖床上4℃過夜孵育（TBS緩沖液=1：1 000），然后TBST洗滌3次，5 min/次，并在室溫下與HRP標記的二抗（TBS緩沖液=1：2 000）孵育2 h。以β-actin為內參，通過化學發光檢測試劑盒在成像系統上對蛋白信號條帶進行分析，Image J圖像處理與分析軟件具體量化蛋白信號值。

1.2.3 RNA文庫構建及測序提取的RNA經8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解程度以及是否有污染。文庫構建及測序均由華大基因公司（BGI）完成。具體的步驟如下：采用mRNA富集法處理total RNA。mRNA富集：以帶有OligodT的磁珠富集含polyA尾的mRNA。以打斷buffer將獲得的RNA片段化，隨機的N6引物進行反轉錄，再合成cDNA雙鏈形成雙鏈DNA。將合成的雙鏈DNA末端補平并5'端磷酸化，3'端形成突出1個“A”的黏末端，再連接1個3'端有凸出“T”的鼓泡狀接頭。連接產物通過特異引物進行PCR擴增。PCR產物熱變性成單鏈，再用1段橋式引物將單鏈DNA環化得到單鏈環狀DNA文庫。對構建好的文庫進行質檢，合格后測序。

1.2.4 生物信息學分析通過HISAT軟件將測序獲得的核苷酸長度（reads）比對至小鼠全基因組。使用DEG-seq軟件包計算基因差異表達情況。根據差異表達倍數、P值和表達量（FPKM）篩選差異表達的mRNA（差異倍數＞1.5，P＜0.05且FPKM＞0.5）。利用華大公司提供的DR.TOM操作系統對篩選出的差異基因進行GO分析和KEGG通路分析，P＜0.05為顯著富集。

1.3 統計學處理本研究數據采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，以±s表示，進行兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05認為差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF在BAT中的表達受到抑制利用已有的四環素調節VEGF可逆抑制小鼠模型，使研究者能夠通過給藥強力霉素（一種四環素類似物）可逆地調節VEGF表達。當鼠糧中含有強力霉素（200 mg/kg）時，tetR蛋白與dox結合，不與tetO結合，VEGF能夠正常表達。在常規食物中，tetR與tetO結合，則抑制了VEGF表達（圖1A）。RT-PCR結果顯示，VEGF mRNA水平在BAT中下降40%（圖1B）。Western blot結果顯示，BAT中的VEGF蛋白下降12%（圖1C、D）。

圖1 VEGF在BAT組織中的表達受到抑制Fig.1 Expression of VEGF in BAT is suppressed

2.2 生物信息學分析

2.2.1 基因的功能注釋以1.5倍表達差異、P＜0.05且FPKM＞0.5為條件篩選差異表達基因，共篩選出953個差異基因，dox-組與dox+組相比，發現上調基因402個，下調基因551個；對差異基因進行GO注釋分析，953個基因在GO注釋中被分為3大類：生物學過程（biological process）、細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）（圖2）。這些基因主要參與細胞過程、代謝過程、免疫系統進程和黏附等生物學過程。

圖2 差異表達基因GO注釋分類Fig.2 GO annotation of differentially expressed genes

2.2.2 差異基因KEGG通路分析KEGG信號通路富集分析結果顯示，富集最為顯著的是細胞因子受體相互作用。此外，在富集前20位的信號通路中，還包括鈣信號通路、胰島素分泌信號通路、IL-17信號通路、趨化因子信號通路等（圖3）。其中IL-17信號通路與細胞增殖、凋亡、代謝及中性粒細胞的募集密切相關。富集到此通路的差異表達基因包括鈣結合蛋白S100a9、S100a8、基質金屬蛋白3（MMP3）、脂質轉運蛋白2（Lcn2）、IL-6，這些基因在dox-組的相對表達量均顯著上調（P＜0.05，表2）。

表2 富集到“IL-17信號通路”的基因Tab.2 Genes enriched to"IL-17 signaling pathway"

圖3 差異表達基因的KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 RT-PCR驗證為了驗證VEGF抑制之后差異表達基因富集到“IL-17信號通路”的表達量變化的真實可靠性，本研究選擇顯著上調的5個差異表達基因（S100a9、S100a8、MMP3、Lcn2、IL-6），設計特異性引物后進行熒光定量PCR驗證。實驗結果顯示，dox-組較dox+組表達明顯上調（P＜0.05，圖4），與RNA-seq顯示的變化趨勢基本一致。

圖4 qRT-PCR驗證轉錄組結果Fig.4 Validation of transcription results with qRT-PCR

3 討論

肥胖已成為一個全球性的健康問題，可導致多種代謝性疾病的發展，如心血管疾病、2型糖尿病和癌癥。目前普遍認為，食用高熱量食物是導致全球肥胖發病率上升的主要原因之一。因此，飲食引起的肥胖對脂肪組織的影響值得關注。WAT是主要的脂肪倉庫，用于儲存能量。BAT是一種線粒體含量豐富、產熱能力強的脂肪組織，專門用于產熱和消耗儲存能量［5］。然而，相對于WAT在HFD誘導的肥胖發展過程中的研究，針對BAT的研究相對較少。最近的研究已經明確，成年人類體內也有棕色脂肪，主要集中在頸部、鎖骨和脊髓等代謝比較活躍的部位，其活性在寒冷環境中增加［6-7］。鑒于BAT能夠燃燒能量，生物醫學界對BAT的研究越來越多，因為其在治療肥胖和肥胖相關并發癥方面具有治療潛力［8-9］。

肥胖與慢性低級別炎癥有關。當受試者喂食高脂飲食時，過剩的營養物質會增加脂肪組織中脂質儲存，并伴隨免疫細胞如巨噬細胞和淋巴細胞的浸潤及炎癥趨化因子的增加，最終導致代謝功能障礙的發展，對人體健康產生負面影響［10-11］。本研究用VEGF可逆抑制小鼠模型揭示了抑制VEGF表達可增加小鼠BAT炎癥反應，并且與IL-17信號通路密切相關。使用RNA-Seq測序分析抑制VEGF表達組與正常VEGF表達組的差異表達基因，并對這些基因進行GO功能和KEGG信號通路分析，發現這些差異表達基因參與機體的多種生物學過程，尤其是細胞過程、代謝過程、免疫系統過程的調節；KEGG富集分析結果表明IL-17信號通路在VEGF抑制表達的BAT中起重要作用，且富集于該通路的基因S100a9、S100a8、MMP3、Lcn2、IL-6表達量顯著上調，表明VEGF可能通過調控IL-17信號通路中關鍵基因的表達，參與BAT的炎癥反應調控。

IL-17是輔助性T細胞（helper T cell，Th）亞群的標志細胞因子，能夠促進天然免疫細胞（如中性粒細胞）的擴張和吸收，并與Toll樣受體（TLR）配體、IL-1β和TNF-α協同作用，增強炎癥反應，刺激β防御素和其他抗菌肽的產生［12］。IL-17在成纖維細胞中被發現能夠激活NF-κB并誘導NF-κB依賴性細胞因子進而促進炎癥產生［13］。隨后的研究發現了IL-17調控的主要炎癥基因，包括促炎細胞因子（IL-6、IL-1、TNF等）、趨化因子（CXCL1、CCL2、IL-8等）、抗菌肽（β防御素、S100蛋白、Lcn2等）、基質金屬蛋白酶（MMPs）和炎癥效應因子［13-14］。JIN等［15］研究發現，IL-17可通過誘導S100A8和S100A9的表達介導特應性皮炎的炎癥反應。此外，IL-17家族還可通過其相應的受體，激活包括NF-κB、MAPK和C/EBPs在內的下游通路，誘導抗菌肽、細胞因子和趨化因子的表達［13，16-17］。新的臨床研究表明，IL-17在肥胖人群中的表達水平較高［18］。飲食誘導的肥胖增加了Th17細胞在脂肪組織和脾臟中的分化，阻斷IL-17可減輕脂肪組織炎癥、促進脂肪細胞分化以及葡萄糖攝?。?9-21］。因此，IL-17在代謝中的作用具有直接臨床意義。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析及對關鍵基因表達的驗證，證實了VEGF對BAT中免疫炎癥因子的轉錄調控作用，當VEGF的表達受到抑制時，BAT的炎癥反應加劇，這一調控機制可能通過激活IL-17信號通路，上調相關炎癥基因的表達實現。