基于脊髓大麻素受體CB2介導的MAPK信號通路探討電針治療膝骨性關節炎慢性痛的機制研究①

樊靜杰 袁普衛鄭潔董博趙莉平（陜西中醫藥大學，西安712046）

膝骨性關節炎（knee ostearthritis，KOA）是一類復雜的全關節疾病，其特征為關節軟骨完整性破壞以及關節邊緣軟骨下骨板病變，表現為關節疼痛和關節功能喪失。KOA疼痛起初表現為間斷性、負重時疼痛，逐漸發展為持續性、慢性疼痛。KOA疼痛具有感受傷害性成分，涉及神經病理性機制，尤其在KOA慢性、持續性疼痛中發揮不容忽視的作用［1］。脊髓敏化是急性痛向慢性痛轉化的重要環節，也是神經病理性疼痛的重要特征［2］。研究發現，KOA疼痛大鼠脊髓背角感覺神經元活性顯著增強，其機制可能涉及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路（以P38和ERK為主）激活［3-4］。大麻素受體2（cannabinoid receptor 2，CB2R）是內源性大麻素系統重要組成部分，脊髓CB2R激活可通過抑制MAPK信號通路發揮抑制神經病理性疼痛作用［5］。電針改善KOA慢性疼痛療效可靠，但相關鎮痛機制尚未明確。本研究以脊髓敏化參與KOA慢性疼痛為切入點，觀察電針對谷氨酸鈉碘乙酸（monoiodoacetate，MIA）誘導的KOA慢性疼痛大鼠行為學、脊髓背角炎癥因子及CB2R和MAPK信號通路的影響，探討電針治療KOA慢性疼痛的機制是否與電針激活脊髓CB2R進而抑制MAPK信號通路及脊髓敏化相關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級健康雌性SD大鼠32只，體重220～260 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（川）2015-030。培養于室溫（20±2）℃，12 h光照/12 h黑暗環境中，自由攝食和飲水，適應性飼養1周后開始實驗。所有實驗動物操作和處理符合國際實驗動物使用準則，保證完成實驗的前提下，盡量減少實驗動物數。

1.1.2 主要試劑與儀器MIA（上海源葉生物科技有限公司）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；0.9%氯化鈉溶液（齊都藥業）；增強型RIPA裂解液、光譜磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、HRP-羊抗兔F、Western blot專用一抗二抗稀釋液（武漢博士德）；Anti-CB2R、Antip38、Anti-ERK1+ERK2、Anti-CREB（美國ABCAM公司）；Western blot轉印濾紙（美國Bio-Rad公司）；PVDF（mil）0.45（瑞士Roche公司）；AB135-S電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；微量注射器（上海高鴿工貿有限公司）；IKA組織勻漿儀（德國IKA公司）；Allegra X-30R離心機（美國Beckman Coulter公司）；37℃孵育箱（北京福意聯醫療設備有限公司）；Bio-Rad 680酶標儀、PL-200熱刺痛儀（成都泰盟軟件有限公司）；Von Frey針刺痛覺測試套件（美國stoelting公司）；云龍牌針灸針（吳江市云龍醫療器械有限公司）；華佗牌電針儀（SDZ-Ⅱ型）（蘇州醫療用品廠有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模32只大鼠隨機分為空白組（8只）、鹽水組（8只）和造模組（16只），造模成功后隨機分為模型組（8只）和電針組（8只）。模型復制采用MIA關節腔注射法［6］。10%水合氯醛（3.5 ml/kg）對大鼠進行腹腔麻醉，左膝關節去毛，碘伏消毒關節周圍區域，采用微量注射器從髕骨下極髕腱外緣向髁間窩方向進針，抵達股骨髁后回抽1 mm，注射50μl MIA（80 mg/ml），注射完畢后屈伸膝關節若干次使MIA均勻分布于關節腔。鹽水組以同樣方法注射50μl生理鹽水。

1.2.2 干預方法電針組在關節腔注射后14 d開始電針干預。治療穴位選取左側陽陵泉和犢鼻穴（外膝眼），取穴以中國針灸學會實驗針灸學分會制定的《常用實驗動物穴位定位圖譜》并參照國家標準《腧穴名稱與定位》（GB/T12346-2006）進行定位。陽陵泉（Yanglingquan GB 34）位于膝部，當腓骨頭前下方凹陷處，犢鼻（Dubi ST 35）位于膝部，髕骨與髕韌帶外側凹陷中。選擇0.18 mm×13 mm一次性針灸針，待針直刺入適宜深度，常規提插或捻轉操作，接通SDZ-Ⅱ型電針儀，疏密波，頻率2/100 Hz交替，電流強度＜2 mA，1次/d，15 min/次，5次為1療程，共治療2個療程。各療程結束后間歇1 d測定痛性行為，再進行下一療程治療。

1.2.3 指標觀察分別于實驗第0（造模前1 d）、3、7、10、14、20、26天進行機械性痛覺超敏測定和熱痛覺過敏測定，評估大鼠痛性行為動態變化。電針干預2療程后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉，生理鹽水灌注，取左側脊髓L3-L5部分。預冷生理鹽水沖洗，稱重，放入事先標記好的EP管內，剪碎，加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，冰上勻漿，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清至新標記的EP管，-80℃保存用于ELISA和Western blot檢測。

1.2.4 痛性行為學評價

1.2.4.1 機械性痛覺超敏測定采用von Frey細絲測定大鼠機械痛縮足閾（methanical withdrawl threshold，MWT）。安靜環境中，室溫（20±2）℃，將大鼠分別置于27 cm×22 cm×28 cm鼠籠內（帶腳墊），適應20 min。按照up-down法，將一系列Von Frey細絲（0.08、0.2、0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0、26.0、60.0、100.0、180.0 g）從2.0 g力度開始垂直刺激大鼠左腳掌中部皮膚，使纖維彎曲5 s，短暫退縮或爪部退縮為陽性反應［7］。重復試驗3次取平均值。

1.2.4.2 熱痛覺過敏測定采用熱輻射測痛儀測定大鼠熱縮足潛伏期（thermal withdrawl latence，TWL）。安靜環境中，室溫（20±2）℃，將大鼠分別置于透明丙烯酸室內（17 cm×11.5 cm×14 cm），適應20 min，將輻射熱設置為50℃并置于后爪足底表面，爪子收縮表明誘發大鼠痛覺，導致紅外線源停止，記錄反應時間（s）。重復試驗3次取平均值。

1.2.5 ELISA檢測左側L3-L5脊髓背角中IL-1β及TNF-α含量取脊髓背角上清，按照BCA蛋白定量試劑盒說明測定上清中蛋白濃度，分別按照IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒說明書進行檢測，酶標儀讀取450 nm處吸光度，按照標準曲線計算IL-1β、TNF-α含量。

1.2.6 Western blot檢測大鼠左側L3-L5脊髓背角CB2R及MAPK信號通路相關蛋白表達取脊髓背角上清，BCA法測定上清中蛋白濃度，將蛋白樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液以4：1混合，煮沸5 min，取50μg等量蛋白樣品在15%SDS-PAGE凝膠電泳中分離蛋白，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，將膜與稀釋的β-actin抗體、CB2R抗體、p-P38、p-ERK抗體、CREB抗體4℃孵育過夜；將一抗孵育后的PVDF膜取出，洗滌10 min×3次，加入稀釋好的二抗HRP-羊抗兔F，室溫下緩慢振動孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次，特超敏ECL化學發光液使膜可視化，Bio-Rad軟件曝光，化學發光/熒光圖像分析系統成像，Image J軟件分析各條帶灰度。以CB2R/β-actin、p-P38/β-actin、p-ERK/β-actin及CREB/β-actin表達作為CREB、p-P38、p-ERK和CREB相對表達。

1.3 統計學分析采用Graphpad Prism7軟件進行統計學分析，所有數據采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時組間比較采用SNK法，方差不齊時采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針干預可明顯提高KOA慢性疼痛大鼠MWT、TWL如圖1所示，MIA注射前，各組大鼠MWL、TWL差異無統計學意義，MIA注射后，模型組大鼠MWL、TWL持續下降，第14天開始維持較低水平，各時間點MWL、TWL與空白組差異顯著（P＜0.001）；電針組MIA注射后到干預前（3 d、14 d），MWL、TWL持 續下 降，與 空 白組 差 異顯 著（P＜0.001），與模型組差異無統計學意義（P＜0.05），電針干預后（14 d、26 d）MWL、TWL明顯升高，與模型組差異顯著（P＜0.001）。

圖1 各組大鼠左側MWL、TWLFig.1 Left MWL and TWL of rats in each group

2.2 電針可降低KOA慢性疼痛大鼠脊髓背角IL-1β和TNF-α含量模型組脊髓背角IL-1β和TNF-α含量顯著升高，與空白組差異顯著（P＜0.01）；電針組脊髓背角IL-1β和TNF-α含量與空白組差異無統計學意義，與模型組差異顯著（P＜0.01，圖2）。

圖2 各組大鼠脊髓背角IL-1β、TNF-α含量Fig.2 IL-1β and TNF-α contents in spinal dorsal horn of rats in each group

2.3 電針上調KOA慢性疼痛大鼠脊髓背角CB2R蛋白表達，下調p-P38、p-ERK、CREB蛋白表達與空白組相比，模型組和電針組脊髓背角CB2R呈高表達（P＜0.001）；與模型組相比，電針組CB2R蛋白表達顯著上調（P＜0.001）。與空白組相比，模型組和電針組脊髓背角p-P38蛋白表達上調（P＜0.001，P＜0.01）；電針組p-P38蛋白表達顯著低于模型組（P＜0.01）。模型組p-ERK和CREB蛋白表達較空白組顯著上調（P＜0.01，P＜0.001）；電針組p-ERK和CREB蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.01），與空白組差異無統計學意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠脊髓背角CB2R、P38、ERK、CREB蛋白表達Fig.3 Expressions of CB2R，P38，ERK and CREB proteins in spinal dorsal horn of rats in each group

3 討論

KOA疼痛的病理機制復雜，涉及軟骨、軟骨下骨、滑膜、肌肉和韌帶等關節局部組織病變，同時涉及外周和中樞神經機制，尤其是脊髓水平的中樞敏化在KOA慢性疼痛過程中起重要作用。臨床研究顯示，在不伴有關節中重度放射學病理改變的膝KOA慢性疼痛患者中，脊髓敏化可能是造成疼痛的主要原因，且決定疼痛嚴重程度［8-9］。

內源性大麻素系統由大麻素受體（主要包括CB1R和CB2R）、內源性配體（內源性大麻素）及參與合成和降解內源性大麻素的酶組成。大麻素內源性配體通過激活CB1R和/或CB2R發揮藥理作用。內源性大麻素存在于整個中樞神經系統的多個疼痛調節區域，包括中腦導水管周圍灰質、延髓腹側區和脊髓背角，這些區域的內源性大麻素水平在慢性疼痛模型中顯著升高，并通過作用于CB1R和CB2R發揮疼痛調節作用［10］。研究發現，內源性大麻素系統在MIA誘導的KOA大鼠脊髓痛覺通路敏化過程中呈現適應性變化，表現為脊髓內源性大麻素含量顯著升高，CB2R在脊髓背角神經元和小膠質細胞中呈高表達，內源性大麻素配體通過作用于CB2R發揮疼痛抑制作用，MIA誘導的CB2R高表達轉基因KOA小鼠痛性行為明顯減少［11-13］。提示脊髓CB2R活化具有抑制KOA疼痛作用，其機制與CB2R活化減輕脊髓痛覺通路超敏化相關。

細胞內信號傳導通路是慢性痛發生與維持的重要機制。MAPK是一組進化上保守的細胞內信號分子，在神經元和膠質細胞的胞內信號傳導中發揮重要作用，激活后通過轉錄和非轉錄水平調節誘導和維持不同持續性疼痛條件下的痛敏反應。MAPK家族中的P38和ERK在神經病理性疼痛進程中的調控作用己被廣泛認可［14］。MIA誘導的KOA大鼠痛性行為與大鼠脊髓水平MAPK信號通路激活密切相關［15］。研究顯示，CB2R活化可下調腰5神經損傷大鼠脊髓背角P38和ERK磷酸化水平，緩解神經損傷大鼠機械性觸摸痛［13］。提示KOA大鼠脊髓背角CB2R激活通過MAPK信號通路（下調p-38和ERK磷酸化水平）抑制脊髓水平的中樞敏化，發揮鎮痛效應。

電針治療KOA療效的系統性回顧和薈萃分析表明，電針干預KOA的療效確切，可緩解膝KOA疼痛，改善KOA綜合癥狀，提高KOA患者生活質量［3］。電針治療KOA時，多以局部選穴為主，其中以犢鼻、陽陵泉、梁丘、血海、足三里和阿是穴較為常用［16-17］；電針治療參數無統一標準，頻率以2 Hz和100 Hz最為常用。電針鎮痛機制研究涉及各種急、慢性疼痛，如炎癥性疼痛、神經病理性疼痛、腫瘤痛和內臟痛等，而電針抑制KOA疼痛的針對性機制研究較少。近年研究發現，電針刺激可抑制脊髓膠質細胞活化產生鎮痛效應：如TU等［18］通過電針刺激慢性限制性損傷（CCI）大鼠模型的同側足三里和陽陵泉穴發現，電針對慢性神經損傷性疼痛過敏有顯著改善作用，與小膠質細胞活性受抑制密切相關；WANG等［19］發現電針陽陵泉、環跳穴可顯著抑制CCI神經痛大鼠脊髓膠質細胞內炎癥因子釋放，減輕痛敏反應。提示電針可抑制神經病理痛模型脊髓水平的痛覺敏化起鎮痛作用，其機制與電針通過p38和ERK信號通路抑制脊髓小膠質細胞活化相關。

MIA關節腔注射是目前國際上廣泛采用的KOA慢性疼痛造模方法，一般在注射第14天后出現類似神經病理性痛成分［20］。本研究顯示，MIA誘導的KOA慢性痛大鼠脊髓背角IL-1β和TNF-α等炎癥因子含量明顯升高，與既往研究報道一致，表明KOA慢性疼痛具有神經病理性成分［3］；MIA關節腔注射后，大鼠脊髓背角MAPK信號通路明顯活化，CB2R表達適應性上調，給予“陽陵泉”“犢鼻”電針處理可顯著上調CB2R表達，下調p-P38、p-ERK和CREB表達，抑制MAPK信號通路活性，抑制KOA大鼠痛性行為。提示電針治療KOA慢性疼痛的作用機制可能與抑制脊髓水平的中樞敏化密切相關，這一效應可能通過活化CB2R進而抑制MAPK信號通路實現。

綜上，脊髓敏化參與OA慢性疼痛過程，其中脊髓背角感覺神經元和膠質細胞激活發揮重要作用；脊髓背角感覺神經元和小膠質細胞CB2R活化后可通過MAPK信號通路（下調p-38和ERK磷酸化水平）抑制脊髓水平的痛覺敏化，發揮鎮痛效應；電針可通過MAPK信號通路抑制脊髓小膠質細胞活化，進而抑制脊髓敏化，達到緩解神經病理性疼痛效應。因此，課題組提出科學假說：電針通過CB2R調控脊髓敏化發揮OA鎮痛效應，這一效應與活化的CB2R對脊髓MAPK信號通路（包括p38和ERK）的抑制作用密切相關，并通過本研究進行了驗證。