miR-27調控SOD2對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響

楊鋼 郭爽黎 錦楊桂（武漢大學中南醫院醫學檢驗科，武漢430071）

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率較高，嚴重威脅女性身體和生命健康。近年新出現的靶向治療特異性強、毒副作用小，在腫瘤治療中取得了突破性進展，新特異性治療靶點是其研究重點［1-2］。miRNA是一類內源性非編碼RNA，可作為腫瘤原癌基因或抑制基因調控腫瘤細胞生長和轉移［3］。如miR-34a過表達可抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲能力［4］；上調miR-155-5p表達，乳腺癌MCF-7細胞侵襲與遷移能力增強［5］。研究發現，miR-27在乳腺癌組織中高表達，與乳腺癌惡性程度及預后有關，可作為乳腺癌新的預后指標及治療靶點［6-7］。但miR-27對乳腺癌進展的影響及其機制尚未闡明。

超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）是一種抗氧化基因，是SOD家族成員，具有抗腫瘤作用，其高表達可增強腫瘤細胞清除活性氧的能力，抑制腫瘤生長及惡性表型［8］。研究發現，SOD2在乳腺癌細胞系中表達下調［9］。但SOD2對乳腺癌的影響尚未闡明。本文旨在研究miR-27對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及機制是否與SOD2相關。

1 材料與方法

1.1 材料乳腺癌MCF-7細胞系購自中國醫學科學院基礎醫學研究所；乳腺癌組織和癌旁組織取自我院腫瘤科患者標本；DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰 蛋 白 酶（美 國Hyclone公 司）；LipofectamineTM2000轉染試劑盒、Trizol試劑、SYBR green試劑盒（美國Invitrogen公司）；BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液（美國Thermo scientific公司）；CyclinD1抗體、p21抗體、MMP-2抗體、E-cadherin抗體、SOD2抗體、GAPDH抗體、羊抗兔IgG-HRP購自北京博奧森生物科技有限公司；MTT試劑盒（上海碧云天公司）；Transwell小室、Matrigel膠（美國BD公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京Solarbio公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養DMEM培養基中加入10%胎牛血清和抗生素進行乳腺癌MCF-7細胞培養，37℃、5%CO2，每1～2 d換液1次，待細胞80%融和時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2 細胞轉染與分組250μl無血清Opti-MEM培養基中加入10μl LipofectamineTM2000轉染試劑，混勻，室溫孵育5 min；100μl Opti-MEM無血清培養基分別加入miR-27陰性對照質粒、miR-27抑制表達載體質粒、miR-27陽性對照質粒、miR-27模擬物、SOD2陽性對照質粒、SOD2過表達載體質粒、miR-27抑制表達載體質粒與SOD2陰性對照質粒miR-27抑制表達載體質粒與SOD2抑制表達載體質粒，混勻，室溫孵育5 min，分別命名為anti-miR-NC組、antimiR-27組、miR-NC組、miR-27組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-SOD2組、anti-miR-27+si-NC組、anti-miR-27+si-SOD2組。將上述轉染試劑和質粒的液體充分混合，室溫孵育20 min，分別加入含有目的細胞的6孔板，37℃、5%CO2、95%相對濕度培養，轉染6 h后將培養液更換為新鮮完全培養基，繼續培養48 h，收集細胞備用。

1.2.3 qRT-PCR檢 測miR-27表 達Trizol法 提 取乳腺癌組織、癌旁組織及anti-miR-NC組、anti-miR-27組細胞總RNA，紫外分光光度發測定RNA純度和濃度，反轉錄為cDNA，按熒光定量試劑盒說明進行操作，各樣品設3個復孔，反應條件為95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40個循環；60℃延長5 min。2-ΔΔCt法計算。

1.2.4 Western blot檢測CyclinD1、P21、MMP-2、Ecadherin、SOD2蛋白表達提取細胞總蛋白，測量濃度，電泳90 min，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉90 min，加入兔抗人CyclinD1抗體、兔抗人p21抗體、兔抗人MMP-2抗體、兔抗人E-cadherin抗體、兔抗人SOD抗體、兔抗人GAPDH抗體，所有抗體按1：800稀釋，4℃孵育過夜；TBST洗膜，加入羊抗兔IgGHRP（1：1 000）二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5～10 min，顯影，定影，Quantity One凝膠分析軟件處理，測量各條帶吸光度，蛋白相對表達水平以目的條帶和GAPDH條帶比值表示，各樣品設3個重復。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖活性anti-miR-NC組、anti-miR-27組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-SOD2組、anti-miR-27+si-NC組、anti-miR-27+si-SOD2組 細 胞培養24 h、48 h、72 h，分別加入20 μl MTT溶液（5 g/L），37℃、5%CO2孵育4 h，吸去孔內培養上清，150 μl/孔加入DMSO，振蕩10 min，充分融解，酶標儀檢測波長490 nm處吸光度。細胞活性（%）=OD實驗組/OD空白對照組×100%。

1.2.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲胰酶消化anti-miR-NC組、anti-miR-27組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-SOD2組、anti-miR-27+si-NC組、anti-miR-27+si-SOD2組細胞，無血清DMEM培養液重懸細胞，調整濃度為5×105個/ml。細胞遷移實驗：取100μl細胞懸液接種于Transwell上室，下室加入含10%FBS的培養液，37℃、5%CO2培養24 h，取出小室，去除培養液，PBS清洗2次，棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS清洗2次，風干，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照，染色細胞數即為遷移細胞數。細胞侵襲實驗：將60μl Matrigel膠加入300 μl無血清DMEM培養液中混勻，取100 μl鋪于Transwell小室上室，37℃成膠，按照細胞遷移實驗步驟操作。顯微鏡下觀察染色細胞數即為侵襲細胞數。

1.2.7 熒光素酶報告實驗檢測miR-27和SOD2的靶向關系TargetScan數據庫顯示，SOD2 3′UTR區與miR-27存在結合位點。構建野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-SOD2和MUT-SOD2，LipofectamineTM2000將WT-SOD2和MUT-SOD2分 別 與miR-NC和miR-27共轉染至MCF-7細胞。按照說明書檢測熒光活性，實驗重復3次。

1.3 統計學分析采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-27在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達與癌旁組織（0.25±0.02）相比，乳腺癌組織中miR-27表達顯著升高（0.86±0.08，P＜0.05），提示乳腺癌組織中miR-27呈高表達。

2.2 抑制miR-27表達對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-27組miR-27表達顯著降低，CyclinD1、MMP-2蛋白表達顯著降低，P21、E-cadherin蛋白表達顯著升高，細胞活性顯著降低，遷移和侵襲數顯著減少（P＜0.05，表1、圖1），提示抑制miR-27表達可抑制MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲。

圖1 抑制miR-27表達對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的影響（×200）Fig.1 Effect of inhibition expression of miR-27 on proliferation，migration，invasion and expression of related proteins of MCF-7 cel（l×200）

表1 抑制miR-27表達對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of inhibition of miR-27 expression on proliferation，migration and invasion of MCF-7 cell（±s，n=9）

表1 抑制miR-27表達對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of inhibition of miR-27 expression on proliferation，migration and invasion of MCF-7 cell（±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

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2.3 miR-27靶向調控SOD2 TargetScan預測顯示，SOD2和miR-27存在結合位點（圖2A）。熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-NC組相比，miR-27組轉染野生型SOD2表達載體WT-SOD2后，乳腺癌細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而突變型SOD2表達載體MUT-SOD2后，乳腺癌細胞的熒光素酶活性差異無統計學意義（表2）。Western blot結果顯示，與miR-NC組相比，miR-27組SOD2表達顯著降低；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-27組SOD2表達顯著升高（P＜0.05，圖2B、表3）。提示miR-27可靶向調控SOD2表達。

表2 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.2 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

表2 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.2 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

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表3 miR-27調控SOD2表達（±s，n=9）Tab.3 miR-27 regulates expression of SOD2（±s，n=9）

表3 miR-27調控SOD2表達（±s，n=9）Tab.3 miR-27 regulates expression of SOD2（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05；compared with antimiR-NC group，2）P＜0.05.

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圖2 miR-27靶向調控SOD2Fig.2 miR-27 targeting regulates SOD2

2.4 過表達SOD2對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲的影響與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-SOD2組CyclinD1、MMP-2蛋白表達顯著降低，SOD2、P21、Ecadherin蛋白表達顯著升高，細胞活性、遷移和侵襲數顯著減少（P＜0.05，圖3、表4），提示過表達SOD2可抑制MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲。

表4 過表達SOD2對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of overexpression of SOD2 on proliferation，migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

表4 過表達SOD2對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of overexpression of SOD2 on proliferation，migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA3.1 group，1）P＜0.05.

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圖3 過表達SOD2對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的影響（×200）Fig.3 Effect of overexpression of SOD2 on proliferation，migration and invasive proteins expressions of MCF-7 cells（×200）

2.5 抑制SOD2表達逆轉抑制miR-27對MCF-7細胞增殖的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-27組CyclinD1蛋白表達顯著降低，SOD2、P21蛋白表達顯著升高，細胞活性顯著降低（P＜0.05）；與anti-miR-27+si-NC組 相 比，anti-miR-27+si-SOD2組CyclinD1蛋白表達顯著升高，SOD2、P21蛋白表達顯著降低，細胞活性顯著升高（P＜0.05，表5、圖4）。提示抑制SOD2表達可逆轉抑制miR-27對MCF-7細胞增殖的抑制作用。

圖4 抑制SOD2表達逆轉抑制miR-27對MCF-7細胞增殖蛋白表達的影響Fig.4 Inhibition of SOD2 expression reversed effect of inhibiting miR-27 on expression of proliferating protein in MCF-7 cells

表5 抑制SOD2表達逆轉抑制miR-27對MCF-7細胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.5 Inhibition of SOD2 expression reverse effect of inhibiting miR-27 on proliferation of MCF-7 cells（±s，n=9）

表5 抑制SOD2表達逆轉抑制miR-27對MCF-7細胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.5 Inhibition of SOD2 expression reverse effect of inhibiting miR-27 on proliferation of MCF-7 cells（±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P＜0.05；compared with anti-miR-27+si-NC group，2）P＜0.05.

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2.6 抑制SOD2表達逆轉抑制miR-27對MCF-7細胞遷移、侵襲的影響與anti-miR-NC組相比，antimiR-27組MMP-2蛋白表達顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高，細胞遷移、侵襲數顯著減少（P＜0.05），與anti-miR-27+si-NC組相比，anti-miR-27+si-SOD2組MMP-2蛋白表達顯著升高，E-cadherin蛋白表達顯著降低，細胞遷移、侵襲數顯著增多（P＜0.05，圖5、表6）。提示抑制SOD2表達可逆轉抑制miR-27對MCF-7細胞遷移、侵襲的抑制作用。

圖5 抑制SOD2表達逆轉抑制miR-27對MCF-7細胞遷移、侵襲及蛋白表達的影響（×200）Fig.5 Inhibition of SOD2 expression reversed effect of miR-27 on migration，invasion and proteins expressions of MCF-7 cells（×200）

表6 抑制SOD2表達逆轉抑制miR-27對MCF-7細胞遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.6 Inhibition of SOD2 expression reversed effect of inhibiting miR-27 on migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

表6 抑制SOD2表達逆轉抑制miR-27對MCF-7細胞遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.6 Inhibition of SOD2 expression reversed effect of inhibiting miR-27 on migration and invasion of MCF-7 cells（±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P＜0.05；compared with anti-miR-27+si-NC group，2）P＜0.05.

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3 討論

腫瘤轉移是導致患者死亡的重要原因，miRNA可在轉錄后水平調控相關基因表達，進而參與調控乳腺癌細胞生長、凋亡、遷移、侵襲等過程［6］。研究報道，miR-27a上調可促進甲狀腺癌細胞遷移、侵襲和血管生成［10］。miR-27過表達可促進多發性骨髓瘤細胞增殖，加快細胞周期進程及細胞遷移和侵襲［11］。miR-27在浸潤性乳腺癌中顯著上調，與腫瘤大小、淋巴結轉移和遠處轉移相關［12］。提示miR-27及miR-27a參與腫瘤細胞轉移，但miR-27對乳腺癌轉移的影響及機制尚未闡明。本研究顯示，乳腺癌組織中miR-27表達顯著升高，提示miR-27在乳腺癌中可能起促癌基因作用。本研究轉染miR-27抑制表達載體，結果顯示，細胞活性、遷移和侵襲數顯著降低，說明抑制miR-27表達抑制MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）參與細胞周期進展，過表達CyclinD1通過誘導細胞周期失調影響乳腺癌細胞生長［13］。P21是一種抑癌基因，在乳腺癌細胞中高表達，具有抑癌作用［14］。研究發現，基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases，MMP-2）主要通過降解細胞外基質促進細胞侵襲，MMP-2異常表達與乳腺癌發生發展及增殖、浸潤轉移等惡性生物學行為密切相關［15］。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）通過調控細胞黏附作用影響細胞轉移，與乳腺癌病理分化程度、臨床分期、淋巴結是否轉移 有關［16］。本研究 抑制miR-27表 達，CyclinD1、MMP-2蛋白表達降低，P21、E-cadherin蛋白表達升高，進一步表明抑制miR-27表達可抑制MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲。

研究報道，肝癌組織中SOD2呈低表達，與肝癌分期、大小、血管侵犯等惡性生物學行為有關［17］。SOD2在胃癌中呈高表達，沉默SOD2表達可抑制胃癌細胞增殖［18］。說明SOD2參與多種腫瘤進展，但其作用可能因不同腫瘤有所不同。研究發現，乳腺癌患者中SOD2活性較低，葉黃素通過誘導抗氧化酶SOD2表達和降低氧化應激水平抑制乳腺癌細胞活力［19］。本研究顯示，過表達SOD2，細胞活性、遷移和侵襲數顯著降低，且CyclinD1、MMP-2蛋白表達降低，P21、E-cadherin蛋白表達升高。說明過表達SOD2可抑制MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲。此外，研究發現，GClnc1通過激活SIRT3/FOXO3/SOD2信號通路促進胃癌SGC7901細胞增殖和遷移［20］。miR-146a通過減少SOD2抑制上皮性卵巢癌的增殖并增強其化學敏感性［21］。本研究發現miR-27可靶向調控SOD2表達，抑制SOD2表達可逆轉抑制miR-27對乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移、侵襲的抑制作用，提示miR-27可能通過調控SOD2表達影響乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-27可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與靶向調控SOD2表達有關，為乳腺癌防治提供新靶點。