聚天冬氨酸尿素及生化抑制劑對(duì)長(zhǎng)江流域典型土壤N2O 排放的影響

劉曼霞，邢志強(qiáng)，張 鑫，付慶靈*，朱 俊，胡紅青，趙洪濤

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北三寧化工股份有限公司，湖北 宜昌 443206）

氧化亞氮（N2O）是一種能在大氣中長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在的溫室氣體［1］，人類活動(dòng)每年造成6.7×1012g N2O-N 排放，其中農(nóng)田土壤排放的N2O約占60%（IPCC 2007）［2-3］。氮肥施用是導(dǎo)致農(nóng)田土壤大量排放N2O的重要原因之一，2017 年我國農(nóng)田土壤N2O-N 排放總量約3.2×1010g，其中79.4%是源于氮肥施用［4-5］。

長(zhǎng)江流域生態(tài)系統(tǒng)在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著重要地位，但是該地區(qū)氮肥施用過量造成大量N2O 排放是一個(gè)不容忽視的問題。據(jù)調(diào)查顯示，在長(zhǎng)江流域農(nóng)民氮肥施用量為N 36～345 kg·hm-2，超出氮肥推薦施肥量20%以上［6］。因此，探討如何減少長(zhǎng)江流域不同地區(qū)N2O 排放，提高氮肥利用率，具有十分重要的意義［7］。

氮肥與脲酶抑制劑、硝化抑制劑或二者復(fù)合使用對(duì)減少N2O 排放具有較好的作用［8-9］。脲酶抑制劑可以有效減緩尿素的水解，從而抑制尿素向銨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化［10-11］。硝化抑制劑通過抑制硝化和反硝化過程，從而減少N2O 排放［10-11］。在眾多脲酶抑制劑的研究中，N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）被證實(shí)在大田和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中均有顯著抑制脲酶活性的作用［12-15］。3，4-二甲基吡唑磷酸（DMPP）減少N2O 排放的作用效果在許多研究中得到證實(shí)［16］，其在低劑量下就可達(dá)到較好效果［17］，并且經(jīng)檢測(cè)無生化毒性［18］。

提高氮肥利用率的另一有效途徑是使用新型尿素替代普通尿素［19-20］。聚天冬氨酸（PASP）是一種可降解的有機(jī)聚合物，可與普通尿素復(fù)配制成新型尿素（PASP 尿素），許多研究證實(shí)，PASP 尿素對(duì)植物吸收N、P、K 等營養(yǎng)元素具有一定促進(jìn)作用，并且可以吸附NH4+，有利于尿素緩慢、持續(xù)供應(yīng)養(yǎng)分［21-22］。

但是，關(guān)于PASP 尿素在長(zhǎng)江流域不同地區(qū)土壤中的作用效果和DMPP、NBPT 以及二者聯(lián)用對(duì)降低長(zhǎng)江流域地區(qū)土壤N2O 排放和提高氮的利用率的相關(guān)研究甚少，更無長(zhǎng)江流域不同地區(qū)土壤間的對(duì)比研究。

本文以長(zhǎng)江上游四川紫色土、長(zhǎng)江中游湖北黃棕壤性水稻土和長(zhǎng)江下游浙江青泥田水稻土為研究對(duì)象，通過不同尿素（普通尿素、PASP 尿素）與抑制劑（DMPP、NBPT）聯(lián)合施用，對(duì)比研究：1.新型尿素較普通尿素的優(yōu)越性；2.NBPT 和DMPP 對(duì)長(zhǎng)江流域不同土壤N2O 排放的影響；3.抑制劑與新型尿素聯(lián)用的作用效果。探討長(zhǎng)江流域不同地區(qū)供試土壤氮轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)和氮肥減損增效效果，為減少該地區(qū)N2O 排放、指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤

供試土壤分別是：長(zhǎng)江上游四川省綿陽縣（105°27′E，31°16′N）紫色土，前茬作物為玉米；長(zhǎng)江中游湖北省廣水市（113°53′E，31°16′N）黃棕壤性水稻土，前茬作物為水稻；長(zhǎng)江下游浙江省平湖市（121°1′E，30°38′N）青泥田水稻土，前茬作物為水稻。

3 個(gè)大田均按5 點(diǎn)取樣法，用鐵鍬采集0～20 cm 耕層土壤，去除石礫和動(dòng)植物殘?bào)w后將所取土壤混合，之后將土壤自然風(fēng)干。四分法取一部分土壤過2 mm 孔徑篩，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫涣硪徊糠滞寥烙糜跍y(cè)定理化性質(zhì)［23］，各地區(qū)供試土壤基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)

1.1.2 供試肥料與抑制劑

供試肥料有普通尿素和聚天冬氨酸尿素（PASP 尿素），其中PASP 尿素由湖北三寧化工股份有限公司提供，含氮量為46%，和普通尿素相同。供試抑制劑包括硝化抑制劑3，4-二甲基吡唑磷酸（DMPP，C5H11N2O4P）和脲酶抑制劑N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT，C4H14N3PS），均購自上海源葉生物科技公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置

為了探討硝化抑制劑和脲酶抑制劑對(duì)供試土壤中尿素轉(zhuǎn)化的影響和添加不同尿素的N2O 排放差異，將采自不同地區(qū)的土壤在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)，每一土壤均設(shè)置8 個(gè)處理，每個(gè)處理進(jìn)行3 次重復(fù)，其中添加普通尿素的4個(gè)處理為：U（普通尿素）、U+D（普通尿素+DMPP）、U+N（普通尿素+NBPT）、U+D+N（普通尿素+DMPP+NBPT）；另外添加PASP 尿素的4 個(gè)處理為：P（PASP 尿素）、P+D（PASP 尿素+DMPP）、P+N（PASP 尿素+NBPT）、P+D+N（PASP尿素+DMPP+NBPT）。其中普通尿素和PASP 尿素的添加量均為N 0.1 g·kg-1干土；DMPP 和NBPT用量分別是施入氮的2%和0.2%。

預(yù)培養(yǎng)時(shí)，稱取1 kg 土樣（干重）于培養(yǎng)盤中，保持田間最大持水量20%的含水量，于25℃條件下在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d 以復(fù)蘇土壤微生物［1］。在此期間保證良好通氣，每隔1～2 d按稱重法滴加超純水補(bǔ)充流失的水分。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將土壤按照每瓶35 g 干土分別裝至250 mL 培養(yǎng)瓶中，并按照試驗(yàn)設(shè)置添加相應(yīng)的尿素和抑制劑，調(diào)節(jié)水分至田間最大持水量60%，于25℃條件下在人工氣候培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)21 d［1］。

正式培養(yǎng)的第1、3、5、7、10、14 和21 d 用氣密性注射器進(jìn)行首尾兩次取氣，測(cè)定其N2O 濃度，并且每次取氣結(jié)束后記錄相應(yīng)時(shí)間。完成第二次取氣后，打開培養(yǎng)瓶用稱重法補(bǔ)水，并充分換氣約2 h。同時(shí)取大約1.5 g 干土至15 mL 離心管中，用于測(cè)定土壤中NO3-、NH4+濃度（每次取土后，按稱重法計(jì)算培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)實(shí)時(shí)土重，以便于后續(xù)N2O 排放計(jì)算）。取樣結(jié)束后，蓋上瓶蓋放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

以上采集的氣體樣品使用氣象色譜儀（Agilent GC7890A）分析N2O 濃度。土壤樣品用2 mol·L-1的氯化鉀溶液浸提NO3-、NH4+，使用AA3 連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定濃度［24］。

1.3 N2O 釋放速率與累積排放量計(jì)算

根據(jù)培養(yǎng)開始后不同時(shí)間測(cè)定的N2O 濃度，使用Slope 函數(shù)計(jì)算N2O 濃度隨時(shí)間變化的曲線斜率，選擇R2＞0.9的數(shù)值，按下式計(jì)算N2O-N 釋放速率：

式 中：F 為N2O-N 釋放速率（μg·kg-1·h-1）；dc/dt 為培養(yǎng)瓶中N2O 濃度隨時(shí)間線性變化的曲線斜率（μL·L-1·h-1）；V 為培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體體積（L）；W為干土質(zhì)量（kg）；ρ為標(biāo)準(zhǔn)狀況下N2O 氣體的密度（ρ=1.978 g·L-1）；T 為培養(yǎng)溫度（K）；α為N2O 換算為N的轉(zhuǎn)化因子（28/44）。

按下式計(jì)算N2O-N 累積排放量：

式中：C 為N2O-N 累積排放量（μg·kg-1），為兩次取氣間隔時(shí)間內(nèi)N2O-N 平均釋放速率（μg·kg-1·h-1），ti為兩次取氣間隔時(shí)間（h）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010 匯總計(jì)算數(shù)據(jù)、Origin 2018C繪圖、SPSS 25 進(jìn)行方差分析和最小顯著性差異法（LSD）比較不同處理之間N2O 釋放量。

2 結(jié)果與分析

2.1 N2O 釋放速率

四川紫色土不加抑制劑的處理N2O 釋放速率先增加后減小，并在第3 d 達(dá)到最大值，N2O-N 48.30 μg·kg-1·h-1（U）和N2O-N 61.08 μg·kg-1·h-1（P），第7 d 后趨于0（圖1a）。添加抑制劑后N2O釋放速率均有所降低，含有DMPP的處理5 d 后趨于0，添加NBPT的處理7 d 后趨于0。該地區(qū)土壤相同處理?xiàng)l件下，添加PASP 尿素比普通尿素的N2O 釋放速率大。

湖北黃棕壤性水稻土所有處理N2O 釋放速率均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。含有DMPP的處理N2O 釋放速率5 d 后趨于0。不添加抑制劑的處理和僅添加NBPT的處理N2O 釋放速率7 d 后趨于0。相同抑制劑處理下，施用PASP 尿素土壤N2O 釋放速率整體上低于施用普通尿素（圖1b）。

浙江青泥田水稻土不加抑制劑的處理，N2O釋放速率先增加后減小，并在第3 d 達(dá)到最大值，N2O-N 10.28 μg·kg-1·h-1（U）和N2O-N 8.60 μg·kg-1·h-1（P），第14 d 后趨于0，并且施用PASP 尿素的處理N2O 釋放速率均低于施用普通尿素的處理對(duì)應(yīng)的N2O 釋放速率。僅添加NBPT的處理N2O 釋放速率先減小再增加，在第7 d 達(dá)到最大值N2O-N 5.39 μg·kg-1·h-1（U+N）和N2O-N 6.08 μg·kg-1·h-1（P+N）后又減小，14 d 后趨于0。含有DMPP的處理N2O 釋放速率接近0（圖1c）。

2.2 N2O 累積排放量

四川紫色土含有DMPP的處理，N2O 排放總量降低了70%～86%，其中僅添加DMPP 效果更佳，可降低80%～86% N2O 排放。僅添加NBPT的處理N2O 排放總量比不添加抑制劑的處理降低14%～22%（圖2a）。

湖北黃棕壤性水稻土僅添加NBPT的處理N2O 排放總量比不添加抑制劑的處理高出4%～46%。含有DMPP的處理，N2O 排放總量降低了7%～53%，其中組合抑制劑效果更佳，降低幅度達(dá)30%～53%（圖2b）。

浙江青泥田水稻土僅添加NBPT的處理，N2O 排放總量比不添加抑制劑的處理降低了26%～60%。含有DMPP的處理，N2O 排放總量降低96%以上，單加DMPP 抑制效果更強(qiáng)，幾乎無N2O 排放（圖2c）。

在3 個(gè)地區(qū)土壤中均表現(xiàn)出：抑制劑對(duì)降低施用普通尿素的處理N2O 排放具有更好的效果，相同處理下，抑制劑對(duì)普通尿素N2O 排放的減少量多于PASP 尿素。在湖北黃棕壤性水稻土和浙江青泥田水稻土中，在不使用抑制劑的情況下，施用PASP尿素其N2O 排放總量比施用普通尿素低40%。

總體上N2O 排放總量表現(xiàn)為湖北黃棕壤性水稻土＞四川紫色土＞浙江青泥田水稻土。

長(zhǎng)江流域3 個(gè)典型土壤N2O 排放總量的分析（表2）顯示，施用不同肥料土壤N2O 排放總量具有顯著差異，使用不同抑制劑對(duì)土壤N2O 排放總量的影響也具有顯著差異，不同土壤經(jīng)相同處理其N2O 排放總量也具有顯著差異。交互分析結(jié)果顯示，不同處理和不同土壤對(duì)N2O 排放總量的交互作用也具有顯著差異。

表2 長(zhǎng)江流域不同典型土壤N2O 排放總量（N2O-N μg·kg-1）

2.3 土壤中銨態(tài)氮含量

四川紫色土所有處理隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，土壤中NH4+-N 含量逐漸增加。湖北黃棕壤性水稻土所有處理隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，土壤中NH4+-N 濃度總體呈下降的趨勢(shì)。浙江青泥田水稻土所有處理隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，土壤中NH4+-N 含量先增加后減小，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)降到初始值以下（圖3）。

四川和湖北供試土壤含DMPP的處理中NH4+-N 含量較高，在第5～7 d 富集最多，土壤中NH4+-N 濃度可達(dá)90～120 mg·kg-1。含NBPT的處理土壤中NH4+-N 濃度比不添加抑制劑的處理低。浙江供試土壤含DMPP的處理土壤中NH4+-N含量較高，含NBPT的處理培養(yǎng)3～10 d 后，土壤中NH4+-N 濃度比不添加抑制劑的處理要高10%～50%。

四川紫色土和浙江青泥田水稻土在相同處理下，施用PASP 尿素土壤NH4+-N 含量略高于施用普通尿素土壤NH4+-N 含量（除浙江青泥田水稻土僅添加NBPT的處理）。湖北黃棕壤性水稻土NH4+-N 含量均較低，施用普通尿素和PASP 尿素土壤NH4+-N 含量相當(dāng)。總體而言，土壤中NH4+-N 含量表現(xiàn)為四川紫色土＞浙江青泥田水稻土＞湖北黃棕壤性水稻土。

2.4 土壤中硝態(tài)氮含量

總體上土壤中NO3--N 含量表現(xiàn)為：四川紫色土＞浙江青泥田水稻土＞湖北黃棕壤性水稻土，3 個(gè)供試土壤不含DMPP的處理NO3--N 含量較高（圖4）。

四川紫色土不含DMPP的處理NO3--N 含量隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)緩慢升高，含有DMPP的處理NO3--N含量隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)升高較快。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)所有處理中NO3--N 含量逐漸接近，所有處理的NO3--N濃度值均在160 mg·kg-1附近（圖4a）。

湖北黃棕壤性水稻土不含DMPP的處理NO3--N含量隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)先升高后降低，在第7 d 達(dá)到最高濃度10～13 mg·kg-1，但培養(yǎng)結(jié)束時(shí)NO3--N 濃度仍高于起始值。含有DMPP的處理NO3--N 含量隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)緩慢升高并保持上升趨勢(shì)（圖4b）。

浙江青泥田水稻土所有處理NO3--N 含量均隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)而升高，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的濃度是起始濃度1.2～3.2 倍（圖4c）。

3 個(gè)供試土壤在不添加抑制劑的情況下，施用PASP 尿素土壤NO3--N 含量總體上高于施用普通尿素的處理，其中湖北黃棕壤性水稻土NO3--N 含量高出部分達(dá)20%～50%。添加抑制劑后，四川紫色土施用PASP 尿素的處理其NO3--N 含量也略高于普通尿素，但湖北黃棕壤性水稻土和浙江青泥田水稻土中NO3--N 含量差異不穩(wěn)定。

3 討論

DMPP 對(duì)降低長(zhǎng)江流域3 個(gè)地區(qū)供試土壤N2O排放具有較好的效果，同時(shí)降低了土壤中NO3-含量。與之相反，3 個(gè)供試土壤中添加DMPP 后NH4+含量比其他處理高。有研究表明，硝化抑制劑的使用會(huì)抑制亞硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)，降低氨單加氧酶活性［25-26］，從而抑制氨氧化過程中NH4+向NO2-的轉(zhuǎn)化，但是不影響后續(xù)反應(yīng)過程［27］。就本試驗(yàn)而言，使用DMPP 后有效抑制NH4+向NO2-的轉(zhuǎn)化，使得NH4+在土壤中積累，并減少了NO2-向NO3-和N2O的轉(zhuǎn)化。

在四川紫色土和浙江青泥田水稻土中，添加NBPT 對(duì)抑制N2O 排放也具有一定的作用。但是在湖北黃棕壤性水稻土中，添加NBPT的處理N2O 排放量反而增加了，這可能是因?yàn)樵摰赝寥榔嵝裕鳱BPT 在酸性土壤中更容易降解，在非酸性土壤中才能較好發(fā)揮抑制尿素水解的作用［28-29］。另外，土壤中脲酶主要由植物、微生物分泌，土壤有機(jī)質(zhì)含量增高會(huì)促進(jìn)微生物活性［10］，湖北黃棕壤性水稻土有機(jī)質(zhì)含量較高，有利于微生物分泌脲酶，故NBPT的抑制效果不佳。

四川和浙江地區(qū)供試土壤僅添加DMPP 抑制N2O 排放效果最佳，而湖北黃棕壤性水稻土中，DMPP 和NBPT 配施效果最好。這可能是因?yàn)椋蛩厮鉃镹H4+釋放一分子OH-，但是NH4+氧化成NO3-釋放兩分子H+，從而使土壤酸化，而硝化抑制劑減弱了氨氧化作用，可以延緩?fù)寥浪峄雇寥纏H 值升高［30-31］，從而更適合NBPT 發(fā)揮作用，二者聯(lián)用加強(qiáng)對(duì)N2O 排放的抑制效果。由前人的研究得知，DMPP 會(huì)通過影響氨氧化微生物的豐度來影響土壤N2O的排放［32］，并且土壤中Cu2+含量也會(huì)影響氨氧化酶的活性［33］。因此，兩種抑制劑在不同土壤中的作用效果差異可能由土壤性質(zhì)、微生物作用等因素不同所致，后期可深入研究不同處理下、不同土壤中微生物的功能差異，從而深入分析土壤氮轉(zhuǎn)化機(jī)理。

3 個(gè)供試土壤施用PASP 尿素后，土壤N2O釋放速率相較于施用普通尿素有所降低，印證了PASP 尿素具有緩慢降解的效果［20-22］。在不使用抑制劑的情況下，湖北黃棕壤性水稻土和浙江青泥田水稻土施用PASP 尿素的處理相較于施用普通尿素，其土壤N2O 排放總量顯著降低，但與抑制劑聯(lián)用后效果不明顯。施用PASP 尿素的土壤中NH4+-N、NO3--N 含量均高于施用普通尿素，提高了氮肥潛在的有效性［34］。結(jié)合PASP的分子特性分析，PASP 尿素發(fā)揮作用主要是由于可以固持NH4+，可能對(duì)減少氨揮發(fā)造成的氮損失具有較好的作用。而氨揮發(fā)受溫度、水分、通氣條件等因素影響較大［35］，而本試驗(yàn)在培養(yǎng)過程中保持相同的溫度和持水量，未測(cè)定土壤氨揮發(fā)指標(biāo)，因此要合理評(píng)估PASP 尿素的減損效果還需進(jìn)一步研究其施用對(duì)氨揮發(fā)的影響。

本研究主要通過測(cè)定N2O 和土壤中不同形態(tài)的氮來分析添加的抑制劑對(duì)長(zhǎng)江流域不同土壤和不同種類肥料的作用效果以及施用普通尿素和PASP 尿素土壤氮轉(zhuǎn)化的差異，但是具體分子調(diào)控機(jī)制尚不明確，后續(xù)可結(jié)合不同培養(yǎng)體系中微生物的響應(yīng)進(jìn)一步探討氮素轉(zhuǎn)化機(jī)理和抑制劑作用效果。

4 結(jié)論

綜合以上結(jié)果，本研究初步得出以下結(jié)論：（1）使用PASP 尿素替代普通尿素對(duì)于減少土壤N2O 排放有一定效果。（2）硝化抑制劑DMPP 有效抑制了長(zhǎng)江流域不同地區(qū)土壤中氨氧化過程；減少了N2O 排放，緩解了溫室氣體造成的危害；減少了土壤中NO3-含量，降低了淋溶造成氮損失的風(fēng)險(xiǎn)。（3）脲酶抑制劑NBPT 在四川、浙江堿性土壤中對(duì)減少N2O 排放也具有一定作用。