基于高通量測序的草莓白粉病病原菌分析

張振榮，田云霞，董瓊娥，譚海燕，張麗芳，馮德黨，賴泳紅，楊俊譽，蘇代發，崔曉龍*，童江云*

(1.昆明市農業科學研究院，云南 昆明 650034；2.云南大學生命科學學院/云南省微生物研究所，云南 昆明 650091)

【研究意義】草莓白粉病嚴重影響草莓產業的發展，造成極大的生產和經濟損失[1]，為了研究草莓白粉病病原菌種類和寄生特性，通過高通量測序技術，分析白粉病病原菌種類，研究不同時期病原菌種類的變化，剛離體和離體一段時間后感病組織的微生物群落變化，分析草莓白粉病病原菌多樣性情況，了解病害發生特點，對防治草莓白粉病有參考價值?！厩叭搜芯窟M展】目前，草莓白粉病病原菌的人工分離純培養還沒有實現，對草莓白粉病病原菌的鑒定主要依靠病原菌分生孢子、子囊果、附屬絲等顯微形態的觀察[2]，鮮有用高通量測序技術或ITS基因測序鑒定草莓白粉病病原菌的報道?！颈狙芯壳腥朦c】利用Illumina MiSeq高通量測序平臺，對云南省昆明市3個主要栽培種冬草莓的白粉病病原菌進行真菌多樣性分析，并將離體白粉病樣品在滅菌培養皿內培養7 d，檢測長出的真菌群落組成，對比病原菌群落變化，了解病原菌離體后的寄生特性?！緮M解決的關鍵問題】明確昆明地區草莓白粉病病原菌種類和寄生特性，為進一步研究草莓白粉病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

實驗所用DNA 抽提試劑盒(FastDNA?Spin kit for Soil)從MP Biomedicals生物醫學公司處購買；GeneJET 膠回收試劑盒從Thermofisher公司處購買。由上海美吉生物醫藥科技有限公司提供MiSeq PE 300 高通量測序系統并進行測序和相關操作。

1.2 樣品采集

于2019年2-4月在云南省昆明市西山區碧雞鎮觀音山草莓種植區(該區域常年種植冬草莓100 hm2左右)，選取草莓白粉病爆發比較嚴重的3個地點，編號為地點1、地點2、地點3。每個地點的草莓面積不低于300 m2，3個地點的草莓發病情況和取樣編號如下。

地點1的采樣時間是2019年2月12日，草莓品種為章姬，大棚內地面土壤栽培，采樣時白粉病主要集中在果上，草莓植株矮小，果實小，略微干癟，白粉粉層明顯，之前用過露娜森農藥，大棚內高溫干燥，土壤缺水明顯。該地點的葉片白粉病樣品編號為ZY1，果實白粉病樣品編號為ZG1。

地點2的采樣時間是2019年4月29日，草莓品種為章姬，大棚內地面土壤栽培，采樣時白粉病主要集中在果實和葉片上，葉片上新葉發病最多，新葉背面白粉粉層比正面多，草莓生長狀況比較好，最近一段時間用過土壤微生物復合菌劑。該地點的葉片白粉病樣品編號為ZY2，果實白粉病樣品編號為ZG2。

地點3的采樣時間是2019年4月29日，草莓品種是紅顏和桃香，大棚內采用基質槽基質栽培，其中紅顏草莓的白粉病主要集中在老葉背面上，果實上有少量白粉，取紅顏感病老葉樣品編號HY；桃香草莓的白粉病主要集中在老葉背面上，多有干赤病斑，果實上沒有白粉，取桃香感病老葉樣品編號TY。

進行白粉病病原菌檢測的ZY1、ZG1、ZY2、ZG2、HY、TY共6組樣品，每組樣品包含6片以上隨機感病葉片(果實)。樣品經滅菌工具采集后，置于無菌采集袋中，迅速帶回實驗室，在無菌操作臺上用無菌脫脂棉擦拭樣品表面的白粉孢子于無菌離心管中，-80 ℃保存，送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序。

被擦拭過白粉孢子的原草莓樣品用于以下實驗，地點2章姬草莓的白粉病果實和葉片(編號ZH)、地點3的紅顏草莓的白粉病果實和葉片(編號HL)，每個樣品隨機選取3片葉片和3個果實，在滅菌大號培養皿內加入無菌水5 mL，封口膜封口，放入人工氣候箱中培養，溫度25 ℃，光強1500 lx，光照時間12 h·d-1[3]，培養7 d，用無菌脫脂棉擦取表面真菌送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina高通量測序。

1.3 不同草莓白粉病樣品的DNA提取及PCR擴增

依照DNA抽提試劑盒說明書提取樣品總DNA，DNA濃度和純度通過NanoDrop 2000檢測， DNA提取質量用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；采用引物ITS3F (5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’)和ITS4R (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對真菌ITS2區進行PCR擴增[4]，PCR反應體系：5 × FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，正向與反向引物各 0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板 DNA 10 ng，補無菌去離子水至20 μL。PCR反應參數： 95 ℃變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，進行35個循環；72 ℃延伸10 min；PCR擴增由ABI GeneAmp?9700型PCR儀所完成。

1.4 Illumina高通量測序

PCR擴增產物使用2%瓊脂糖凝膠進行回收，用QuantiFluorTM-ST(Promega, USA)進行定量，最后用MiSeq PE 300進行測序，實驗中的樣品均由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成測序。

1.5 數據處理

高通量測序的原始數據用Fastp 軟件(version 0.19.6，https://github.com/OpenGene/fastp)進行質控，用Flash軟件(version 1.2.11，https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml)拼接， 用Uparse軟件(version 7.1，http://drive5.com/uparse/)在97%的相似度下對序列進行OTU聚類并去掉單序列及嵌合體，用RDP Classifier(version 2.11，http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋，在70%閾值下利用Mothur 軟件(version 1.30.2，https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur)將OTU與Unite (version 7.2，https://unite.ut.ee/)真菌數據庫進行比對[5-7]。通過樣品的稀釋曲線、物種組成、物種差異等評估不同樣品的真菌群落結構及多樣性；Coverage 指數通過計算各個樣本文庫的覆蓋率反映樣本測序的深度和合理性，數值越高表明樣本中序列被檢測出的概率越高，測序結果越可靠[8]。以上分析通過上海美吉生物醫藥科技有限公司云平臺(www.majorbio.com)進行。

2 結果與分析

2.1 測序深度分析

原始序列經優化處理后，8組樣品， ZY1、ZG1、ZY2、ZG2、HY、TY、ZH、HL獲得有效序列分別為71198、37793、59732、54618、54832、30558、71697和74360條。

由圖1可知，樣品的稀釋曲線已趨于飽和，即使增加測序數據深度也無法再找到更多的OTU，表明現有測序數據深度已合理，測序結果能全面和真實的反映所有樣本中真菌群落的多樣性[8]。

2.2 草莓白粉病病原菌種類

如圖2所示，檢測草莓白粉病病原菌的6個樣品：ZY1、ZG1、ZY2、ZG2、HY、TY，白粉病病原菌多樣性分析結果基本相同，即在屬水平上群落組成分析均顯示98.8%以上是叉絲單囊殼屬Podosphaera。

2.3 離體培養后的兩個白粉病樣品群落組成分析

離體白粉病樣品在滅菌培養皿內培養7 d后，HL(地點3的紅顏果實和葉片)樣品上長出許多淺綠色的粉狀霉菌，群落組成分析顯示真菌菌屬為青霉屬Penicillium(88.80%)、Cladosporium(9.38%)、Acremonium(1.44%)、others(0.25%)；ZH(地點2的章姬果實和葉片)樣品上長出許多黑色粉層的霉菌，群落組成分析顯示真菌為曲霉屬Aspergillus(86.87%)、

2.4 白粉病原菌不同樣品的真菌菌落比較分析

由表1和圖4可以看出，剛離體的6個白粉病樣品結果非常接近，物種組成非常相似，但與離體7 d后的2個樣品(HL和ZH)真菌群落組成存在顯著差異。

表1 ZY1、ZY2、ZG1、ZG2、HY、TY、HL、ZH樣品真菌群落組成(相對豐度)

3 討 論

實驗顯示，2019年2-4月昆明地區3個冬草莓栽培種章姬、紅顏、桃香的白粉病病原菌均為叉絲單囊殼屬Podosphaera，不同草莓品種和感染部位的白粉病病原菌相同，這是首次報道中國西南地區草莓白粉病病原菌種類。因草莓白粉病病原菌屬于專性寄生菌，目前還沒有實現人工離體純培養[1]，所以暫時無法用基因測序技術鑒定到種。草莓白粉病病原菌為叉絲單囊殼屬Podosphaera，這個結果與王佩玲等[3]在2017年用顯微鏡觀察陜西楊凌‘早紅’草莓品種鑒定草莓白粉病病原菌為子囊菌門核菌綱白粉菌目叉絲單囊殼屬的報道相同。但也有報道顯示了不同的研究結果，Pei 等[9]于2017 年首次報道，2014年4月河南商丘地區60%草莓爆發白粉病，利用ITS1/ITS4擴增rDNA并測序，結合形態觀察鑒定當地草莓白粉病的病原菌為Golovinomycesorontii；關玲等[10]將草莓白粉病的病原表述為子囊菌亞門真菌(Sphaerothecamacularisf.sp.Fragariae)；劉博等[11]研究發現，草莓白粉菌為羽衣草單囊殼[Sphaerothecaaphanis(Wallr.)Braun]，屬子囊菌亞門白粉菌目白粉菌科單囊殼屬，經核對文獻后發現有誤，陳桂清等[12]并沒有羽衣草單囊殼侵染草莓或草莓屬植物，該研究叉絲單囊殼屬Podosphaera的寄主植物有薔薇科的蘋果屬、梨屬、梅屬、山楂屬、繡線菊屬、花楸屬以及樺木科的樺木屬植物上，也沒有提及草莓屬植物，說明引用將草莓白粉病病原菌表述為羽衣草單囊殼[Sphaerothecaaphanis(Wallr.)Braun]，是錯誤的。

草莓白粉病病原菌感病的部位離開母體植株后，感染部位表面很快生長出其他真菌菌落，新長出的菌以青霉屬和曲霉屬為主，而原白粉病原菌不再是優勢菌群，說明草莓白粉病病原菌是活體營養寄生菌，即病原菌只能在活的植物上生長發育和繁殖，從活的植物組織中得到營養完成生活史，一旦離體后生長減弱甚至被其他菌完全覆蓋，支持了白粉菌是活體營養寄生的觀點。同時也說明，利用草莓葉片制作葉盤來進行離體感染和鑒定[13]的方法可能是不科學的。此外，感染白粉病的草莓植株，一般出現白粉層、葉片老化和萎蔫的癥狀，很長一段時間甚至整個生育期都不會死亡，可能與該病原菌的寄生特性有關，或許可以用陳相永等[14]提到的“死體營養型致病菌需要通過增強植物細胞壁的降解作用來實現廣譜侵染，而活體營養型致病菌通過弱化植物細胞壁的降解能力來避免誘發寄主出現病征或死亡”加以解釋。在侵染部位方面，白粉病原菌侵染章姬品種上多個部位，果實和葉片都有，而在紅顏和桃香上，更喜歡侵染葉片，有可能跟這兩個品種的果實化學成分不同有關，比如實驗中發現，草莓果實口感偏甜時更容易感染白粉病，而口感偏酸的果實很少染白粉病。

4 結 論

2019年2-4月昆明地區冬草莓栽培種的白粉病病原菌為叉絲單囊殼屬Podosphaera，不同草莓品種和感染部位的白粉病病原菌相同，是首次報道中國西南地區草莓白粉病病原菌種類。草莓白粉病病原菌感病的部位離開母體植株后，感染部位表面很快生長出其他真菌菌落，原白粉病原菌不再是優勢菌群，說明草莓白粉病病原菌是活體營養寄生菌。該病原菌還表現出侵染周期長、侵染不同品種的不同組織的特性。