湖南桃江病圃稻瘟病菌生理小種鑒定及其毒性分析

李 杰，李小娟，肖友倫，任佐華，鄧力喜，夏新格，朱 艷，劉二明*

(1. 湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省植物保護研究所，湖南 長沙 410125；3.遵義師范學院生物與農業科技學院，貴州 遵義 563006; 4. 湖南農業大學農學院，湖南 長沙 410128)

【研究意義】稻瘟病菌[Magnaportheoryzae(Hebert)Barr]無性態為Pyriculariaoryzae(Cook)Sacc，是稻梨孢屬真菌，由其引起的水稻稻瘟病是我國水稻三大病害之一，一般可引起水稻減產10%～30%，嚴重的可達50%以上甚至絕收[1]。據報道，全球每年因稻瘟病造成的水稻產量損失高達1000萬t以上，經濟損失達數百億美元[2]；近年我國稻瘟病的年均危害面積在7500萬 hm2左右[1]。實踐證明，在眾多的防治措施中，選育和利用抗病品種是控制該病害最經濟、安全和有效的措施[1-2]，而抗瘟性鑒定評價則是開展抗病育種研究的重要環節。迄今為止，在稻瘟病選擇壓力大、病菌群體遺傳組成豐富的病圃中進行自然誘發仍是最有效、最可靠和最經濟的抗瘟性鑒定評價方法[3]。然而，由于水稻稻瘟病菌生理小種的多樣性和易變性，大部分水稻品種在推廣種植3～5年之后抗性下降甚至喪失[4]。因此，開展病圃稻瘟病菌生理小種的鑒定研究，有針對性地篩選稻瘟病抗源與抗性品種，進而加快稻瘟病抗性品種的培育與合理利用進程，對稻瘟病的可持續防治具有重要意義。【前人研究進展】為客觀反映各稻區稻瘟病的實際發生情況與對抗病育種進行科學指導，通常要在同一稻區不同生態區域的稻瘟病常發或重發區設立多個自然誘發病圃，并利用7個中國鑒別品種測定病圃內的稻瘟病菌生理小種組成情況。如廣東省至今設立了3個代表性病圃[5]，湖南省也設立了3個代表性病圃對區試品種進行抗瘟性鑒定[6-8]，廣西、湖北、云南、貴州等地的情況也類似[9-12]。廣東省3個稻瘟病圃分別設址于陽江、龍川及從化呂田，姜先芽等[13]研究表明陽江病圃稻瘟病菌的優勢生理小種為ZC13，其次為ZB13；康金平等[14]研究顯示龍川病圃稻瘟病菌的優勢生理小種為ZB13,其次是ZC13；楊建源等[5]研究發現，從化呂田病圃稻瘟病菌的優勢生理小種為ZB13，其次是ZB5、ZC13；這揭示，廣東3個病圃的優勢生理小種較為一致，而鐘寶玉等[15]研究發現廣東省的優勢生理小種也為ZB13，表明這3個病圃的小種類型在廣東省具有代表性。湖南省3個稻瘟病圃分別設址于桃江、瀏陽、鳳凰，其中桃江病圃位于湖南省益陽市桃江縣高橋鄉羅溪村，長期是長江中下游稻區和湖南省水稻新品種區試的稻瘟病抗性鑒定基地。近年來，虞選杰等[16]、毛銳等[17]、周瑚等[18]先后研究了桃江稻瘟病圃病菌的遺傳多樣性情況，均顯示該病圃稻瘟病菌群體的遺傳差異大、遺傳結構復雜，但未對病菌的生理小種類型進行鑒定。【本研究切入點】桃江病圃稻瘟病菌群體遺傳多樣性豐富、優勢小種在湖南省具有代表性，但近10年來未對桃江病圃稻瘟病菌的生理小種組成與毒性進行過研究。【擬解決的關鍵問題】通過在番茄燕麥培養基上誘導產孢測定64個分離菌株的產孢能力，利用離體接種鑒定技術并基于接種菌株在7個中國鑒別品種上的抗感反應，分析桃江病圃稻瘟病菌群體的生理小種類型與毒性，旨在為湖南省乃至長江中下游地區抗稻瘟病品種選育與利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試鑒別品種 7個中國鑒別品種分別為特特普、珍瓏13、四豐43、東農363、關東51、合江18、麗江新團黑谷，均由湖南省農科院植物保護研究所繁殖并提供。

1.1.2 供試稻瘟病菌 2018年在桃江病圃(湖南省益陽市桃江縣高橋鄉羅溪村)采集稻瘟病穗頸瘟標樣100份，通過單孢分離法獲得稻瘟病菌64個，菌株名錄及來源水稻品種(系)名稱詳見表1。

1.1.3 培養基 水瓊脂培養基(Water agar medium)：瓊脂30 g，加水定容至1 L，滅菌。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato dextrose agar medium)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，加水定容至1 L，滅菌。

番茄燕麥培養基(OTA medium)：燕麥片40 g(煮沸過濾)，番茄汁150 mL，瓊脂18 g，pH 6.5～6.7，加水定容至1 L，滅菌。

1.2 鑒定方法

1.2.1 菌株產孢 將分離獲得的64個稻瘟病菌接種到番茄燕麥培養基上(培養皿直徑6 cm)進行活化，待菌絲長滿后，加入2 mL水，用棉簽輕刮下培養基表面的菌絲并打散；再用1 mL移液槍將菌絲液轉移至新的番茄燕麥培養基上(培養皿直徑6 cm)，滅菌玻璃棒涂布均勻，于超凈工作臺上吹干后，放入培養箱中28 ℃黑暗培養2～3 d；然后用棉簽將培養基表面菌絲輕擦去，置于光照培養箱中28 ℃藍黑光照培養3～4 d，即可獲得大量分生孢子。每皿加2 mL無菌水洗下孢子，顯微鏡下用血球計數板統計孢子數量，測定菌株的產孢能力。

1.2.2 菌株生理小種鑒定 (1)播種與育苗。供試鑒別品種預先在室溫下進行催芽，露白后播種于塑料育秧盆中，每品種30粒左右。育苗土為田間土壤，秧苗接種前5～7 d施用一次尿素。

(2)制備孢子懸浮液。分離的稻瘟病菌株在番茄燕麥培養基上誘導產孢完成后，先加2 mL無菌水于培養皿中，再用油畫筆洗下分生孢子，最后將孢子濃度調至1×105個/mL接種備用。

(3)離體葉片劃傷接種。待水稻秧苗長至4葉期時，參照并改良張海旺等[19]方法進行水稻離體葉片劃傷接種。先用消過毒的剪刀將其葉子剪成4 cm左右葉段，再用槍頭垂直主葉脈處制造2個微創傷口但不穿透葉片；將葉片放入預先加有6-BA溶液的培養皿(直徑9 cm)中，把10 μL孢子液滴在葉片傷口上；然后將接種后的培養皿置于28 ℃黑暗條件下放置24 h，最后在28 ℃光照/黑暗交替條件下放置5～7 d，感病品種麗江新團黑谷充分發病后調查記錄抗感反應類型。每處理3次重復。

(4)確定稻瘟病菌生理小種類型。根據張海旺等[19]離體葉片接種采用的標準進行調查：葉片劃傷處呈褐色點狀病斑，記為“R”；病斑呈梭形，最外層是淡黃色的中毒部，形狀不規則，記為“S”。記載鑒別品種的抗(R)感(S)反應類型，參照全國稻瘟病生理小種聯合試驗組(1980)的標準[20]進行病菌生理小種分類和毒性分析。

1.2.3 病圃自然誘發鑒定 稱取7個中國鑒別品種的種子各10 g，經浸種、催芽于2018年5月21日播種于湖南桃江病圃中，秧箱兩邊播種鑒別品種，中間播種誘發品種湘晚秈11號，當苗齡在4～6葉期時調查，具體調查方法與分級標準參照文獻[6]執行，當誘發品種發病在7級以上時，調查7個中國鑒別品種的發病情況，0～4級為“R”反應，5～9級為“S”反應。

1.3 統計分析

采用Excel2013軟件，分別對不同分離菌株的產孢數量進行平均值與標準差分析，根據在7個鑒別品種上的抗感反應進行生理小種類型劃分，在此基礎上統計各生理小種出現的頻率并作出柱形圖。

2 結果與分析

2.1 桃江病圃稻瘟病菌的產孢能力分析

通過在OTA培養基上培養與藍黑光燈誘導產孢，孢子洗脫后利用血球計數板統計孢子數量(表2)，9-1-1、17-1-1、17-1-6、20-1-1、20-2-1、31-1-1、X7-1-16、X7-1-2、X7-1-3等9個菌株產孢能力最強，孢子數量在100×104個/mL以上；其次是6-1-1、6-2-1、9-2-1、31-1-3、31-2-1、33-1-2、35-2-2、S3-4-1、X1-1-8等9個菌株，產孢數量達50～100×104個/mL；而1-2-1、2-1-1、3-1-6、7-1-6、7-1-6、8-1-1、8-2-1、11-1-2、15-1-2、18-1-1、27-1-1、27-1-6、35-2-1、35-2-3、65-2-1、65-2-2、S3-1-1、S3-4-1、S8-2-4等35個菌株產孢數量為10～50×104(個/mL)之間；但3-2-4、S3-4-2、S4-1-7、S4-3-1、S8-1-7、S8-1-8、S8-1-9、S8-2-5、S8-4-2、X1-2-1、X7-1-7等11個菌株產孢低于10×104個/mL。以上結果比表明，來源桃江病圃的不同稻瘟病菌株在產孢能力上存在明顯差異，其中產孢量在10×104個/mL以上的53個菌株繼續生理小種鑒定研究。

表2 桃江病圃分離獲得的64個稻瘟病菌株的產飽數量分析

續表2 Continued table 2

2.2 桃江病圃稻瘟病菌生理小鑒定結果分析

對從桃江病圃分離獲得的稻瘟病菌進行生理小種鑒定，共鑒定出4群12個生理小種(表3)，即ZA群，僅有ZA1生理小種；ZB群里有ZB1、ZB3、ZB5、ZB11、ZB13、ZB15、ZB31等7個生理小種，ZC群里有ZC3、ZC13、ZC15等3個生理小種；ZG群里只有ZG1生理小種。對各菌群與小種的出現頻率進行分析，在ZA、ZB、ZC、ZG 4個種群中，出現頻率最高的為ZB，頻率為79.2%，其次是ZC，頻率為17.0%；頻率最低的是ZA、ZG，均僅為1.9%，這表明桃江病圃稻瘟病菌優勢種群為ZB。在ZA1、ZB1、ZB3、ZB5、ZB11、ZB13、ZB15、ZB31、ZC3、ZC13、ZC15、ZG1等12個生理小種中，出現頻率最高的是ZB15(圖1)，頻率為39.6%；其后依次是ZB1、ZC3、ZB5；出現頻率最低的是ZA1、ZB11、ZC15、ZG1，僅為1.9%；這表明桃江病圃稻瘟病菌的優勢生理小種為ZB15。

表3 桃江病圃稻瘟病菌生理小種鑒定結果

7個中國鑒別品種在桃江自然誘發病圃的鑒定結果表明(圖2)，誘發品種湘晚秈11號的病級為9級；7個鑒別品種中，麗江新團黑谷為9級，四豐43為8級，珍瓏13為7級，皆呈感病(S)反應；其余4個品種特特普、東農363、關東51、合江18均為抗病(R)反應；因此7個鑒別品種在病圃也依次呈現“RSSRRRS”的反應類型，這與優勢生理小種ZB15在7個鑒別品種上的反應型吻合。

2.3 桃江病圃稻瘟病菌群體的毒性分析

根據接種菌株在7個中國鑒別品種上的抗感反應，對桃江病圃稻瘟病菌群體的毒性進行分析，表明強毒生理小種ZB1出現頻率達15.1%，比例僅次于優勢生理小種ZB15，ZB1除了在特特普上呈現抗病(R)反應，其余皆是感病(S)反應(圖3-a)。之后按出現頻率高低依次是ZB5、ZC3，這兩個生理小種的毒性也較強。毒性最強的ZA1在7個鑒別品種上都呈感病(S)反應(圖3-b)，在桃江病圃中也被分離鑒定到。以上結果揭示，桃江病圃稻瘟病菌群體的毒性較強。

3 討 論

7個中國鑒別品種被廣泛用于我國各稻區稻瘟病菌生理小種鑒定，其鑒定結果對指導水稻抗稻瘟病育種及抗性品種的合理布局具有重要參考價值[15, 21-23]。湖南桃江病圃是長江中下游國家與湖南省水稻區試新品種的稻瘟病抗性鑒定基地，本研究通過將稻瘟病菌接種于7個中國鑒別品種的離體葉片上，基于抗感反應把2018年桃江病圃稻瘟病菌劃分為4群12個生理小種，其中優勢種群為ZB，占比79.2%；優勢生理小種為ZB15，比例達39.6%。優勢生理小種ZB15在7個鑒別品種上的抗感反應型依次為RSSRRRS(R表抗病，S表感病)；2018年將7個鑒別品種種植在桃江病圃使其自然發病，結果也依次呈RSSRRRS的反應型；這表明，離體接種鑒定的優勢生理小種類型與田間是吻合的，揭示桃江病圃田間稻瘟病菌的優勢生理小種為ZB15。

近年來，尚沒有對湖南桃江病圃稻瘟病菌進行生理小種研究的報道。對湖南省而言，最近的報道來自黃紅梅等[24]的研究，他們對采自湖南省瀏陽、桃江、煙溪等17 個縣市的303個稻瘟病菌株進行生理小種鑒定，共鑒定出7 群41個生理小種，其中ZB 為優勢種群，ZG1為優勢小種，其次為ZB13小種。可見，ZB群是湖南省稻區稻瘟病菌的主要優勢種群，而桃江病圃稻瘟病菌的優勢種群也為ZB，這表明桃江病圃稻瘟病菌種群在湖南具有代表性。但是，桃江病圃稻瘟病菌群體的優勢生理小種、毒性與湖南省存在差異，桃江病圃病菌的毒性明顯強于湖南省各地采集分離的病菌，這與周瑚等[25]的研究較為一致，分析其原因主要有：①桃江病圃四面環山、日照時間短、結露時間長、濕度大，極有利于稻瘟病發生，這保證了菌株的大量充分繁殖，同時增強了菌株的毒性變異性；②病圃每年均要承擔上萬份水稻品種、資源及低世代材料的抗瘟性鑒定，且病圃每年都會淘汰感和高感稻瘟病的水稻材料，保留下來的材料大部分表現中感或中抗水平，能使這些材料致病的菌株往往毒性較強[6]。因此，經桃江病圃鑒定篩選出的抗病品種或資源在湖南省水稻生產與抗性育種上得到了廣泛應用。然而，由于7個中國鑒別品種的遺傳背景不明，對稻瘟病抗性育種與品種布局的指導作用有限，下一步研究宜利用單基因品種對稻瘟病菌進行致病型劃分。

稻瘟病菌誘導產孢是接種前的關鍵環節，離體接種要求病菌的分生孢子產生量在10×104個/mL孢子以上。本研究通過將稻瘟病菌絲液轉移至番茄燕麥培養基上，用藍黑光連續照射誘導培養獲得了大量分生孢子，但不同菌株在產孢能力方面存在明顯差異。早期相關研究也表明培養基與光照條件對菌株的產孢量影響最大[26-27]。孫國昌等[26]研究認為玉米粉稻稈培養基最適宜用于稻瘟病菌誘導產孢；王寶華等[27]比較了幾種培養基的誘導產孢效果，發現燕麥片培養基誘導稻瘟病菌產孢的效果最好。孫國昌等[26]研究還進一步發現波長310～430 nm的藍黑光連續照射能顯著地促進稻瘟病菌分生孢子的產生。因此，建議番茄燕麥培養基加藍黑光連續照射以大量誘導稻瘟病菌產生分生孢子。

4 結 論

本研究對2018年分離自湖南桃江病圃的64個稻瘟病菌株進行產孢能力分析，結果表明，番茄燕麥培養基加藍黑光連續照射可有效誘導這些菌株產生分生孢子，但在產孢能力方面不同菌株存在明顯差異。利用7個中國鑒別品種對其進行生理小種鑒定與毒性分析，結果顯示，測定的53個菌株被劃分為4群12個生理小種，優勢種群為ZB，優勢生理小種為ZB15，強毒生理小種ZB1出現頻率較高，還出現了毒性最強的ZA1小種；這揭示，桃江病圃稻瘟病菌群體的毒性較強，經桃江病圃鑒定與篩選出的抗病品種或資源將在湖南省乃至長江中下游地區的水稻生產與抗性育種上發揮重要作用。