腫節風炭疽病菌拮抗放線菌的篩選與鑒定

宋利沙，蔣 妮，張占江，藍祖栽，白隆華

(廣西壯族自治區藥用植物園，廣西 南寧 530023)

【研究意義】腫節風(Sarcandraglabra)為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物草珊瑚[S.glabra(Thunb.)]的干燥全草，具有活血消斑、清熱涼血、祛風通絡等功效，是中國藥典的收錄品種[1-2]，也是廣西傳統瑤藥“七十二風”中的重要風藥品種之一[3]。近年來，腫節風在廣西融安、靖西、東蘭等縣市大面積種植，從苗期到成株期均出現由半知菌類刺盤孢屬黑線炭疽菌(Colletotrichumdematium)引起的葉部病害，平均發生率在50%以上，尤其在融安的林下套種模式下發病率達65%[4]。目前，腫節風炭疽病的防治以化學藥劑為主，但長期使用化學藥劑容易產生病原菌抗(耐)藥、病害易復發及農藥殘留等負面問題[5]。世界上50%的生物活性化合物由放線菌產生，尤其是鏈霉菌產生的多抗霉素、井崗霉素和阿維菌素等抗生素已成為實際利用的次級代謝產物[6-8]，并已在農業生產中廣泛應用，但至今利用放線菌防治腫節風炭疽病的研究尚屬空白。因此，篩選拮抗腫節風炭疽病病原菌的放線菌，對腫節風炭疽病的生物防治具有重要意義。【前人研究進展】鏈霉菌存在于不同類型的土壤和水中，資源豐富，能產生多種抗菌活性的抗生素，已在生物防治上廣泛應用[9-10]。牛紅杰等[11]研究顯示，從黃瓜根際土壤分離得到的小鏈霉菌對黃瓜枯萎病病菌(尖孢鐮刀菌、茄腐鐮刀菌和立枯絲核菌)具有一定的抑制作用。劉琴等[12]研究表明，徹氏鏈霉菌100倍液灌根對番茄枯萎病的防治效果最佳，達72.84%。涂璇等[13]、申哲等[14]研究發現，淡紫灰鏈霉菌對番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌、玉米彎孢病菌、小麥赤霉病菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫病菌、小麥紋枯病菌、棉花立枯病菌、油菜菌核病菌及蘋果樹腐爛病菌等多種植物病原菌均有很強的拮抗作用，具有潛在生防價值。Dame等[15]研究發現，從海洋放線菌中分離獲得的4種抗生素(寡霉素a和b、巴馬霉素和棘孢鏈菌素)可抑制葡萄霜霉病病菌(Plasmoparaviticola)孢子游動，使其細胞壁溶解，達到防治葡萄霜霉病的目的。Sellem等[16]研究認為，鏈霉菌發酵提取物可使腐霉菌(Pythiumultimo)菌絲生長受到抑制及卵孢子畸形扭曲。Phuakjaiphaeo等[17]研究表明，從積雪草(Centellaasiatica)根節分離得到1株內生鏈霉菌，其代謝產生的化合物可導致甘藍黑斑病菌(Alternariabrassicicola)分生孢子畸形、附著胞不能形成及孢子萌發延遲。Shrivastava等[18]研究顯示，印度恒河平原土壤中分離得到的嗜鹽放線菌(K20)產生的幾丁質酶可溶解菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)的菌絲細胞壁，從而發揮明顯的拮抗作用。【本研究切入點】利用生防菌防治植物病害已成為植物病害防治的重要方法之一及國內外研究熱點，也是未來綠色中藥材發展的趨勢，但目前關于篩選拮抗腫節風炭疽病病原菌放線菌的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】從健康腫節風植株根系土壤中篩選拮抗腫節風炭疽病病原菌的放線菌菌株，分析確定其分類地位，采用離體葉片刺傷接種法測定所篩選獲得拮抗菌株對腫節風炭疽病的防效，以期為腫節風炭疽病的生物防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

腫節風炭疽病菌(編號Z1)由廣西壯族自治區藥用植物園實驗室分離、鑒定和保存；土壤樣品采自廣西靖西市五嶺林場腫節風健康植株根系土壤。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌發酵液制備 腫節風健康植株根系土壤取樣時采取五點取樣法將整株腫節風挖起，用無菌小毛刷刷取植株根系上的土壤，每5株的根系土壤均勻混合為一個樣品(200 g)，重復3次，共計15株，編號后封存于保鮮袋中帶回實驗室，48 h內采用稀釋涂布平板法在高氏一號培養基上進行放線菌分離，并通過平板對峙試驗，計算分離得到的放線菌對腫節風炭疽病菌的抑制率，篩選對黑線炭疽病具有拮抗活性的放線菌[19-22]。將抑制率最高的拮抗菌株用于下一步抑菌譜試驗。挑取抑制率最高的拮抗菌株(JT-2F菌株)單菌落接種于不加瓊脂的高氏一號培養基中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩3 d，得到拮抗菌株的發酵液，用無菌紗布和濾紙過濾后，10 000 r/min離心15 min，取上清液，經0.22 μm濾膜過濾，得到拮抗菌株的無菌發酵液。

1.2.2 JT-2F菌株抑菌譜測定 供試藥用植物病害病原真菌三七灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七根腐病菌(Fusariumsolani)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)、三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、羅漢果斑枯病菌(Stagonosporopsiscucurbitacearum)、苦玄參葉斑病菌(Alternariaputuminum)、廣西莪術葉斑病菌(Phomopsissp.)、豆蔻葉斑病菌(Phyllostictasp.)和艾納香褐斑病菌(Phomasp.)均由廣西壯族自治區藥用植物園實驗室分離、鑒定、保存；農作物病害病原菌西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉葉斑病菌(Alternariasp.)和煙草灰霉病菌(Botrytiscinerea)均由廣西大學植病研究室袁高慶教授提供。

選取1.2.1中對腫節風炭疽病菌防效較佳的放線菌JT-2F和DT-3F菌株，參照程麗娟等[20]、朱宏建等[21]、張瑾等[22]的平板對峙法對上述14種植物病原菌進行抑菌譜測定。將直徑為0.5 cm的病原菌組織塊置于PDA平板中心，在其兩側等距離處分別接種JT-2F和DT-3F菌株組織塊，以單獨接種病原菌為對照，每處理3個重復。待對照長滿整個平皿時，測量菌落直徑并計算抑制率。抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100。

1.2.3 JT-2F菌株離體防治試驗 參考刺傷接種法進行放線菌對炭疽病菌離體防效試驗[23]。選取大小一致的腫節風葉片，先用自來水沖洗干凈，75%酒精表面消毒，無菌水沖洗、晾干后置于超凈工作臺，再用無菌接種針在葉片上刺傷一個直徑為6.0 mm的圓形接種面，然后分別在傷口處涂抹(200 μL)稀釋10、20、50、100和200倍JT-2F菌株的無菌發酵液及原液，最后在傷口處接種直徑7.0 mm的腫節風炭疽病菌菌餅，以涂抹無菌水為對照，重復3次。接種5 d后參考薛應鈺等[24]的方法測量并記錄病斑面積，采用十字交叉法測量病斑長度，計算病斑面積及防效。病斑面積=1/4×π×病斑長徑×病斑短徑；防效(%)=(對照病斑面積-處理病斑面積)/對照病斑面積×100，選取防效高的JT-2F菌株進行抑菌譜測定、形態鑒定和分子學鑒定。

1.2.4 JT-2F菌株鑒定 ①形態鑒定。用劃線法將JT-2F菌株接種至高氏一號培養基上，28 ℃培養約10 d，觀察菌體的形態特征[25]。②分子生物學鑒定。將培養3 d的JT-2F菌株接種至40 mL不加瓊脂的高氏一號培養基三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養48 h后制成菌體懸浮液，離心收集菌體，采用改良的SDS裂解法用DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取放線菌基因組DNA。采用放線菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')對提取的DNA進行PCR擴增(由生工生物工程(上海)股份有限公司完成)。反應體系25.0 μL：模板DNA(20～50 ng/μL) 0.5 μL，10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.0 μL，酶0.2 μL，上、下游引物各0.5 μL，加雙蒸H2O至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，進行30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增中利用水代替DNA模板為空白對照。PCR擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化測序，測序結果與GenBank的序列進行BLAST比對。

1.3 統計分析

試驗數據采用SPSS 19.0進行統計分析，以MEGA 4.0的Neighbor-Joining法構建16S rDNA相似序列系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 拮抗放線菌的分離與篩選結果

從腫節風健康植株根系土壤中共分離得到具有拮抗活性的15株放線菌，其中，3株對腫節風炭疽病菌抑制率<60.00%，10株抑制率為60.00%～80.00%，2株抑制率>80.00%(編號分別為JT-2F和DT-3F，表1)。JT-2F菌株對腫節風炭疽病菌的抑制率最高，為86.75%，顯著高于其他14株菌株(P<0.05，下同)；DT-3F對腫節風炭疽病菌的抑制率(80.54%)次之，顯著高于除JT-2F和DT-6F外的其他菌株。與正常的炭疽病菌菌絲(圖1-A)相比，在對峙培養中腫節風炭疽病病原菌菌絲的生長明顯受到JT-2F菌株抑制(圖1-B)；分別挑取培養7 d的對照組和處理組黑線炭疽菌菌絲在顯微鏡下觀察，結果發現對照組的菌絲直且粗細均勻(圖1-C)，而JT-2F菌株處理組的菌絲體發生畸變，菌絲纏繞扭曲，部分菌絲顏色變深，菌絲體膨大(圖1-D)。說明JT-2F和DT-3F菌株對腫節風炭疽病菌有很好的抑菌效果(抑制率均在80.00%以上)。

表1 拮抗放線菌對腫節風炭疽病菌的抑制效果比較

2.2 拮抗菌株對腫節風炭疽病菌的離體防效

JT-2F菌株的離體防治試驗結果表明，隨著發酵液稀釋倍數的提高防效相應降低(圖2)，發酵液原液的防治效果達87.32%，且顯著高于其他處理(表2)；當發酵液稀釋至50倍時，防治效果下降到54.62%，稀釋至100和200倍時，防效分別下降至30.08%和25.50%，防治效果不理想。

表2 JT-2F菌株發酵液對腫節風炭疽病菌的防治效果

2.3 拮抗放線菌抑菌譜

以JT-2F和DT-3F菌株對14種植物病原菌進行抑菌活性測定，結果發現JT-2F菌株的平均抑制率達81.50%，顯著高于DT-3F菌株的平均抑制率(表3)。其中，JT-2F菌株對農作物病原菌的抑制率均在70.00%以上，尤其對香蕉炭疽病菌的抑制率最高，達89.41%，對西瓜枯萎病菌的抑制率雖較低，但仍達71.18%；JT-2F菌株對藥用植物病菌艾納香褐斑病菌的抑制率最高，為87.50%，對豆蔻葉斑病菌的抑制率較低，但仍達72.94%，對其他藥用植物病原菌的抑制率均達到75.00%以上。可見，JT-2F菌株對腫節風炭疽病具有較好的生防應用前景。

表3 JT-2F和DT-3F菌株對14種植物病原菌的抑菌譜

2.4 拮抗菌株的鑒定結果

2.4.1 形態鑒定結果 JT-2F菌株在高氏一號培養基上開始呈白色，后期呈灰色菌落，菌落邊緣呈乳白色表面褶皺，孢子卵圓形。菌絲生長旺盛，顏色為白色。

2.4.2 分子生物學鑒定結果 JT-2F菌株用通用引物16S rDNA序列進行PCR擴增和測序，獲得1404 bp核苷酸序列。將該序列與NCBI中GenBank的序列進行BLAST比對，結果發現JT-2F菌株與鏈霉菌屬(Streptomyces)同源性很高，相似度達100.0%(表4)。采用MEGA 4.0對JT-2F菌株的16S rDNA序列進行系統發育進化樹構建，結果(圖3)表明，JT-2F菌株與S.tsukiyonensisAB184594菌株序列在系統發育進化樹上處于同一個分支，屬津島鏈霉菌(S.tsukiyonensis)。根據菌株的形態學特征及16S rDNA分子鑒定結果，初步鑒定JT-2F菌株為津島鏈霉菌，序列登錄號MK368447。

表4 系統發育進化樹分析中使用的放線菌菌株序列

3 討 論

鏈霉菌屬是放線菌類群中的最大成員之一，具有抗菌防病功能，且抑菌譜廣，可產生多種抗生素[26]，對開發生物農藥和生物制劑具有潛在應用價值。已有研究表明，纖維黃鏈霉菌(S.celluloflavus)和S.yatensis對香蕉枯萎病菌菌絲的抑制率分別達70.12%和54.46%[27]，婁徹氏鏈霉菌(S.rochei)Lj20對番茄灰霉病菌具有較強的抑制作用[28]，紫黑鏈霉菌(S.vioiaceoniger)對山藥炭疽病菌具有較好的拮抗作用[29]，殺黃孢鏈霉菌(S.xanthocidicus)對白色假絲酵母(Candidaalbicaus)CMCC 98001和恥垢分枝桿菌(MycobacteriumSmegmatis)MC2的抗菌活性較強[30]，新種閘坡鏈霉菌(S.zhapoensis)對花生青枯菌具有較強的拮抗作用[31]，放線菌S.griseinus對葡萄白腐病菌具有良好的抑制效果[32]，黃暗色鏈霉菌(S.xanthophaeus)Ac16抑制草莓灰霉病菌能力較強[33]，天藍鏈霉菌放線菌素變種(S.coeruleofuscusvar.actinomycini)屬于對常見植物病原菌(黃瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、玉米小斑病菌、蘋果斑點落葉病菌、番茄早疫病菌和棉花黃萎病菌)有較強抑制活性的放線菌[34]。本研究從健康腫節風根際土壤中分離到1株對腫節風炭疽病菌具有較強拮抗作用的鏈霉菌菌株JT-2F，對14種供試病原菌(包括香蕉、煙草和西瓜等5種農作物病原真菌及三七、艾納香、豆蔻和廣西莪術等9種藥用植物的病原真菌)均具較強的拮抗作用；通過形態學特性和16S rDNA鑒定，JT-2F菌株屬于津島鏈霉菌；離體防效試驗結果顯示，JT-2F菌株發酵原液對離體葉片上腫節風炭疽病的防效達87.32%。但是關于津島鏈霉菌在生物防治中的作用機理、在田間的拮抗效果、對腫節風生長有無促生作用及如何與生物農藥和生物制劑配合使用等仍需進一步探究。

鏈霉菌發酵液能產生多種次級代謝產物[24]，在生物防治中常采用液體發酵方式產生拮抗活性物質以應用于植物病害防治。段學輝等[35]研究發現，紫黑吸水鏈霉菌(S.violaceoniger-hygroscopicus)的發酵液對辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、番茄灰病菌(B.cinerea)和黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)具有一定抑制作用。李勇等[36]研究顯示，放線菌YIM31249發酵液粗提物對灰霉病菌的最小抑制濃度為0.022 mg/mL，表明發酵液中具有天然抗菌活性物質。榮曉瑩等[37]研究發表明，灰色鏈霉菌(S.griseus)FQ-017 對苗期番茄灰霉病的防治效果較佳。本研究將JT-2F菌株在不加瓊脂的培養基中發酵，發現其發酵液原液可使腫節風炭疽病菌菌絲畸形、膨大，表明JT-2F菌株發酵液中有抗生類物質產生，且發酵液在一定范圍內對腫節風炭疽病菌菌絲生長的抑制效果隨稀釋倍數增大而減弱，與已報道的焊灰直絲鏈霉菌(S.chungwhensis)和紫色鏈霉菌(S.spurpureus)的抑菌效果相似[38-39]。

本研究僅將不加瓊脂的放線菌培養液發酵后應用于腫節風炭疽病菌拮抗試驗，在今后的研究中還應通過單因素和正交試驗進行鏈霉菌發酵條件優化，以期得到最優培養條件用于后期推廣應用。

4 結 論

JT-2F菌株對腫節風炭疽病菌具有較強的拮抗作用，可使炭疽病菌菌絲膨大、畸變和扭曲，抑制率達86.75%，且對14種病原真菌也具有較強的拮抗作用，平均抑制率達81.50%；其發酵原液對腫節風離體葉片上腫節風炭疽病的防效達87.32%。因此，JT-2F菌株用作腫節風炭疽病菌的生物防治材料具有較大開發和應用潛力。