30種觀葉秋海棠花粉活力檢驗方法篩選及活力測定

2021-08-23 03:29:26杜文文蔡晶晶林培勝馬璐琳王祥寧賈文杰崔光芬

西南農業學報 2021年7期

杜文文，段青，楊楠，蔡晶晶，林培勝，馬璐琳，王祥寧，賈文杰，崔光芬*

(1.云南省農業科學院花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術研究中心，云南昆明 650205；2.云南農業大學園林園藝學院，云南昆明 650201；3.大姚縣六苴鎮農業農村服務中心，云南大姚 675400)

【研究意義】秋海棠屬于秋海棠科秋海棠屬，多年生草本植物，約1900種、15000多個園藝品種[1-2]。依據觀賞性，可分為觀花、觀葉和花葉兼賞3類[3]，其中觀葉類葉形、葉色變化豐富，有很多種類具有多彩的葉斑，深受人們喜愛，是極佳的花鏡材料，具有市場前景。培育新的觀葉秋海棠品種，不僅可以滿足市場需求，還能創造新的種質，豐富該物種的多樣性。雜交育種是新品種選育的重要手段，較高的花粉活力是確保授粉受精正常進行的前提條件[4]，因此，測定秋海棠花粉活力能為優良授粉品種選配提供重要依據，有效提高雜交結實率，對雜交育種成功與否具有實際指導意義。【前人研究進展】花粉活力最常用的測定方法有染色法[5-7]和花粉離體培養法[8-10]。染色法操作簡便，能快速測定花粉活力，但受花粉自身特性影響大，穩定性差，離體培養法雖能較真實反應花粉活力，但在無資料可參考的情況下，需進行一系列預備實驗，以確定最適培養基和培養條件，操作復雜[11-13]。因此，不同種類應選擇合適的方法檢測其花粉活力。目前有關秋海棠花粉活力的報道較少，且主要為野生種類，陳雄偉等[14]采用I2-KI染色法測定了紫背天葵(B.fimbristipulaHance)花粉活力，花開后3 d活力最強。通過離體培養，趙寶林等[15]觀察到中華秋海棠[B.grandisDry subsp. (A. DC.) Irmsch]從開放幾小時到即將萎蔫的雄花花粉均有活力。彭鏡毅等[16]運用孢粉染色法檢測出臺北秋海棠(Begonia×taipeiensis)花粉敗育率極高。Dewitte 等[17]用Fluorescein diacetate (FDA)染色法觀測南美洲秋海棠7個雜交組合后代的花粉活力，平均活力只有3.5%，73%的雜交后代敗育。【本研究切入點】觀葉秋海棠種類較多，而針對更多的野生種和市場上流行的商業品種的花粉活力研究較少。【擬解決的關鍵問題】以30種觀葉秋海棠為試材，采用不同方法測定其花粉活力，尋找測定秋海棠花粉活力的有效方法，比較不同種類之間花粉活力大小的差異，為觀葉秋海棠雜交育種提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

30種觀葉秋海棠，種植于云南省農業科學院花卉研究所秋海棠育種基地，包括15個野生種和15個商業品種，均具一定觀賞性。

1.2 試驗方法

各種類秋海棠的花期集中在9-10月，中午采集盛花期雄花帶回實驗室，采用不同方法測定花粉活力，同時采集了火焰開放1～8 d的雄花和雌花，觀察火焰不同開放天數雄花花粉的活力和雌花柱頭的可授性。

1.2.1 TTC染色法稱TTC 0.5 g或1 g溶解于100 mL 磷酸鹽緩沖溶液中，配好的溶液倒入棕色試劑瓶內，4 ℃保存待用。檢測時選取5個種類，先進行預實驗，取2～3滴TTC染液于載玻片上，用毛筆將它們的新鮮花粉分別輕彈到各自載玻片溶液中，35 ℃恒溫箱染色30 min 左右，鏡檢，紅色花粉粒有活力，淡紅色或無色花粉粒活力低或無活力[6]。重復6次，每個玻片取6個視野進行統計，每個視野中的花粉粒數不少于30 粒。若5個種類均可染色，則其他種類也采用此方法。

花粉活力(%)=紅色花粉數量/觀測花粉總數 × 100

1.2.2 I2-KI 染色法配置2% I2-KI 溶液，置于棕色試劑瓶中4 ℃保存待用。方法與TTC法類似，先進行預實驗，染色10 min后在顯微鏡下觀察，有活力的花粉呈藍色，活力衰弱或內含物少的花粉呈黃褐色[6]。若預實驗成功，則用該方法檢測所有種類花粉。

花粉活力(%)= 藍色花粉數量/觀測花粉總數 × 100。

1.2.3 孢粉染色法參照陳家瑞[18]的孢粉染色法。稱取95%乙醇10 mL，孔雀綠10 mg，蒸餾水50 mL，丙三醇25 mL，酚5 g，水合氯醛5 g，酸性品紅50 mg，桔紅G 5 mg，冰醋酸1～4 mL，配制孢粉染液，其中冰醋酸量的加入依孢粉壁的厚度而定，薄的用1～2 mL，厚的用3～4 mL。配好的試劑倒入棕色瓶內，暗處保存。檢測方法同上述方法，室溫染色30～40 min后顯微鏡下觀察。有活力的花粉原生質紅色，無活力的花粉細胞壁被染成綠色。

花粉活力(%)=紅色花粉粒數/觀測花粉粒總數 × 100

1.2.4 離體培養法離體培養基為10% 蔗糖 + 0.01% H3BO3+ 0.01% CaCl2+ 0.02% MgSO4·7H2O+0.01% KH2PO4的固體培養基或液體培養基。將培養基倒入培養皿中，花粉均勻撒在培養皿上，25 ℃光照或黑暗培養3～4 h，花粉管萌發長度超過1/2 花粉直徑，則視為具有活力。3 次重復，每個重復觀察6個視野，求平均值作為花粉萌發率，同樣選取5個種類進行預實驗。

花粉萌發率(%)= 萌發花粉粒數/觀測花粉粒總數 × 100

1.2.5 柱頭可授性采用聯苯胺-過氧化氫法測定[19]，將火焰不同開放天數雌花的柱頭，置于聯苯胺-過氧化氫溶液中，反應液配方為1%聯苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22(體積比)。若柱頭具有可授性，其周圍呈現藍色并有大量氣泡產生。

1.2.6 數據處理采用SAS軟件對不同種類的花粉活力進行單因素方差分析，使用R軟件繪制30種秋海棠花粉活力大小、聚類圖與火焰不同開放天數花粉活力變化。

2 結果與分析

2.1 4種花粉活力測定方法比較與分析

銀點秋海棠(B.deliciosaLinden ex Fotsch)、火焰、晚秋紅、冰川和蕾絲洛森的花粉經TTC 溶液或I2-KI溶液染色后，花粉顏色均未有明顯變化，染色時間延長，效果仍不理想；花粉經過夜離體培養后未觀察到萌發；孢粉染色法中所有種類花粉均可被染色，且能很好的區分有活力花粉和敗育花粉(圖1)，這一結果表明TTC和I2-KI染色法可能不是檢測秋海棠植物花粉最有效的方法，實驗所用的離體培養基不適合秋海棠植物花粉活力檢測，相比較其他3種方法，孢粉染色法可用于秋海棠植物花粉活力的快速測定。

2.2 不同種類花粉活力大小比較與分析

由于TTC染色、I2-KI 染色和花粉離體萌發培養3種方法均未獲得有效數據，實驗結果只針對孢粉染色法測定的數據進行分析。所有種類花粉均可被染色，且能很好的區分有活力花粉和敗育花粉(圖1-c)。測定的30種秋海棠花粉均有活力，花粉活力范圍為34.83%～98.58%，花粉活力橙花秋海棠(B.croceaC.I Peng)最高(98.58%)，火焰最低(34.83%)，極差為63.75%；不同種類之間花粉活力差異大，15個野生種中，除中華秋海棠(B.grandis)(76.66%)、坪林秋海棠(B.pinglinensisC. I Peng)(79.59%)、棱角秋海棠(B.angularisRaddi)(82.61%)和歪葉秋海棠(B.augustineiHemsl)(84.32%)4個種類花粉活力低于85%外，其余11個的均高于90%，野生種的平均花粉活力為91.39%。15個商業品種中，紅寶石鞋花粉活力高，為90.81%，蕾絲洛森、北極風、火燒云和晚秋紅花粉活力在80%～90%，分別為87.32%、86.95%、86.02%和83.42%；花粉活力在 70%～80%有4個，為星光(79.24%)、粉絲帶(77.90%)、煙霞(75.73%)和薩爾薩(75.61%)，而非洲叢林(68.11%)、紅色探戈(65.04%)和埃特納(61.67%)3個品種的花粉活力則在60%～70%，冰川花粉活力稍低于60%，為58.61%，小可愛(43.88%)和火焰(34.83%)花粉活力均低于50%，商業品種的平均花粉活力為71.67%(表1，圖2)，說明測定的30種觀葉秋海棠中，野生種的平均花粉活力較商業品種高。一般雜交選配時，除觀賞性、抗逆性、授粉親和性、花粉活力外，花粉量也是選擇父本的重要因素[20]，采集花粉時發現，所測的28個花粉活力較高的種類，其花粉量也較多，花粉活力低的小可愛和火焰花粉量則偏少，因此，雜交時橙花秋海棠、紅寶石鞋等28個種類可以做父本，小可愛和火焰則做母本更好。

表1 30種秋海棠花粉活力

除柳葉秋海棠(B.fuchsioidesHook.)和長翅秋海棠(B.longialataK. Y. Guan & D. K. Tian)、彩紋秋海棠(B.masonianavar.maculataS. K. Chen, R. X. Zheng & D.Y. Xia)和光滑秋海棠(B.psilophyllaIrmsch.)、蕾絲洛森和北極風、粉絲帶和中華秋海棠、煙霞和薩爾薩、非洲叢林和紅色探戈、埃特納和冰川花粉活力標注的字母一樣外(P>0.05)，其他種類花粉活力兩兩比較，標注字母均不同，有的種類間還存在顯著差異(P<0.05)；火焰和小可愛相比，花粉活力差異顯著，且二者顯著低于其他28種秋海棠(P<0.05，表1)。采用最短距離法對30種秋海棠進行聚類，在遺傳距離0.2處，可將30種秋海棠分為6個類群，第Ⅰ類群包含12個種類，花粉活力均在90%以上，第Ⅱ類群也包含12個種類，花粉活力在75%～90%，第Ⅲ類群包含兩個種類，為非洲叢林和紅色探戈，花粉活力在70%左右，第Ⅳ類群也包含兩個種類，為埃特納和冰川，花粉活力在60%左右，第Ⅴ類群和第Ⅵ類群都只包含一個種類，分別為小可愛和火焰，花粉活力均低于50%(圖3)，說明秋海棠花粉活力多樣性豐富。

2.3 火焰花朵開放不同天數花粉活力和柱頭可授性分析

火焰花粉量少，花朵開放1 d的雄花散粉極少，數據不易采集，開放8 d花朵萎蔫，常脫落，故只觀測了花朵開放2～7 d的花粉活力，也說明火焰單花周期為7 d左右。開花后2、3、4、5、6、7 d，花粉活力均較低，分別為32.48% 、32.51%、33.28%、42.15%、36.82%、36.47%，花粉活力大小變化趨勢為先增大后減小，花開后5 d花粉活力最強(42.15%,圖4)。柱頭可授性表明，火焰雌花自開放到凋落，其柱頭均有可授性，因此，該種類雜交時更適合做母本。采集雄花時發現花藥散粉量會隨開放天數增加而增多(圖5)，雜交育種中有采用火焰花粉進行授粉獲得雜交種子的情況，因此，若以火焰為父本進行雜交，宜采用開放5 d的雄花進行授粉。

火焰葉片肉質，卵形，整個葉片為紅色，有金屬光澤，符合中國人的審美，具有較好的市場前景，但株形松散、不緊湊，降低了觀賞性，且不利于包裝和運輸，為獲得更多的雜交種子，培育更好的紅色觀葉秋海棠品種，可以用火焰為母本，與株型緊湊的父本品種進行雜交，或者以株型緊湊的品種為母本，采用開放5 d左右的火焰花粉進行授粉，選育葉色、株型更優良的后代。

3 討論

3.1 秋海棠花粉活力測定方法

研究中采用4種方法檢測秋海棠花粉活力，結果TTC和I2-KI 染色效果不理想，離體培養基上未見花粉萌發，只有孢粉染色法可以很好地區分有活力花粉和無活力花粉，前人采用I2-KI染色和離體培養法分別檢測紫背天葵和中華秋海棠的花粉活力[14-15]，與預實驗結果有不同，這可能是所選擇的秋海棠種類不同或溶液或培養基配方有差異所致；彭鏡毅等[16]使用孢粉染色能有效觀察臺北秋海棠花粉活力，也有相同實驗結果。

測定的30種觀葉秋海棠，不同種類之間花粉活力存在差異，野生種中有11個花粉活力在90%以上，其余4個的也高于75%；商業品種中花粉活力較高的有紅寶石鞋(90.51%)、蕾絲洛森(87.42%)、晚秋紅(83.42%)和星光(79.24%)等，而火焰和小可愛花粉活力則偏低，實際雜交過程中也發現測定的部分野生種如光滑秋海棠、掌葉秋海棠、銀點秋海棠等和部分商業品種如蕾絲洛森、北極風、晚秋紅、星光等自交和雜交結實率均較高，而火焰與其他種類雜交時，雜交結實率低、小可愛做父本幾乎不能獲得雜交種子，說明孢粉染色法所得數據可靠，可以作為測定秋海棠植物花粉活力的一種快速有效測定方法。

3.2 秋海棠多樣性與可育性

秋海棠多樣性極其豐富，種類、生態、生境、形態特征、染色體、基因組大小等方面均表現出多樣性[21-23]。通過最短距離法可以將30種秋海棠分為6個類群，花粉活力大小分別為90%以上、75%～90%、70%左右、60%左右、45%左右和35%左右，說明秋海棠花粉活力也存在多樣性，進一步豐富了對秋海棠屬植物多樣性的認識。

花粉活力能夠作為反映雄配子發育狀況的一項指標，對花粉活力進行分級，可以將不同品種劃分為不同等級的育性，并為后續雜交親本選配提供依據。一般花粉可育率為0，定為全不育；小于5%，為高不育；6%～30%，為半不育；31%～50%，為低不育；大于50%，為正常可育[24]。參照這種等級法，可將30種觀葉秋海棠劃分為正常可育和低不育兩類，其中正常可育含有28個種類，雜交時可以做父本，低不育有2個種類，適宜做母本。

3.3 花粉活力變化

檢測到火焰不同開放天數花朵的花粉活力隨開放天數的增加先增大后減小，開放后5 d活力最高。紫背天葵花朵的花粉活力也是隨開放天數的增加呈先增加后下降的趨勢，開花后3 d 花粉活力達到最高(76.0%)[14]。楊小丹等[25]在研究不同品種蘭花花粉活力時，發現國蘭花粉活力在花朵開放0 ～20 d處于增長期，之后花粉活力隨花朵開放時間的增加而降低。因此，雜交時應先確定植物花粉活力最高的時期，并選擇該時期進行雜交授粉，這樣有助于提高雜交結實率。