瘦素對西門塔爾牛屢配不孕的影響及與生殖激素相關性分析

曲 苗，孫亞偉，閆向民，李紅波，姚 剛，張 楊，李 娜*

(1. 新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 新疆畜牧科學院畜牧所，新疆 烏魯木齊 835000)

【研究意義】生活水平提高，人們對肉類的需求大大提升，西門塔爾牛是一種乳肉兼用的品種，深受廣大消費者喜愛，但西門塔爾牛在生產上容易出現屢配不孕現象，養殖的經濟效益達不到預想結果。導致牛屢配不孕的疾病有很多，如卵巢囊腫[1]、陰道炎[2]、輸卵管疾病、持久黃體、子宮內膜炎[3]等疾病。【前人研究進展】研究表明，在引起肉牛繁育率降低的幾種疾病中，屢配不孕占全部疾病的53.06%[4]。但一些牛沒有明顯的生殖疾病特征，例如：直腸檢查無卵巢囊腫，無陰道疾病等，仍然出現屢配不孕的狀況。LEP是由肥胖基因指導的，由脂肪組織分泌的一種蛋白質激素[5]，具有生殖調節功能[6]。LEP作為一種調節信號，作用于下丘腦—垂體—性腺軸及胎盤和子宮等來調控哺乳動物的繁殖過程[7]。林戎等人研究表明LEP會影響胎兒宮內的生長發育[8]，Guzmán A等[9]發現LEP濃度降低，影響神經肽的分泌增加，在這種負調節的作用下，使得GnRH分泌減少。這一系列研究都表明LEP對生殖調節可能起著重要的作用。【本研究切入點】前人研究表明LEP影響生殖活動，但目前LEP與屢配不孕的研究相對較少。【擬解決的關鍵問題】為探究LEP與屢配不孕的關系，本試驗通過對西門塔爾牛血清LEP和各生殖激素含量進行檢測，深度分析除生殖疾病以外，可能導致西門塔爾牛屢配不孕的內在因素，以期為預防及治療牛屢配不孕提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品的采集

試驗動物為伊寧市某牛場產后13 d的西門塔爾牛，其生長環境和飼養管理條件一致，共計19頭，根據其配種次數將其分為2組，分別為健康組(配種1次或2次成功)16頭和屢配不孕組(配種3次以上不孕)3頭，使用氯前列醇鈉(PG)對其進行同期發情處理，分別在產后14、28和42 d注射PG，每頭牛注射3 mL。從產后13 d開始每周采集1次試驗牛的靜脈血5 mL，在3000 r/min的條件下離心血樣，離心10 min，分離血清，置于液氮保存。

1.2 試驗試劑

瘦素(LEP)酶聯免疫試劑盒(貨號：JYM0106Bo)，促性腺激素釋放激素(GnRH)酶聯免疫試劑盒(貨號：JYM0083Bo)，促卵泡生成素(FSH)酶聯免疫試劑盒(貨號：JYM0055Bo)，促黃體生成素(LH)酶聯免疫試劑盒(貨號：JYM0054Bo)，雌激素(E2)酶聯免疫試劑盒(貨號：JYM0057Bo)，孕激素(PROG)酶聯免疫試劑盒(貨號：JYM0056Bo)，均由武漢基因美公司提供。氯前列醇鈉注射液(PG，寧波第二激素廠，0.2 mg*10支)。

1.3 試驗方法

根據發情周期將試驗分為產后恢復期(產后0～40 d)、第1個發情期(產后41～62 d)、第2個發情期(產后63～84 d)、第3個發情期(產后85～106 d)4組。使用酶聯免疫吸附法(ELISA)[10]試劑盒對血清中的LEP、GnRH、FSH、LH、E2和PROG進行檢測。

1.4 數據分析

使用Excel制作回歸曲線，并做圖對比LEP濃度在兩組樣品中的變化規律。使用SPSS 21.0進行獨立樣本T檢驗，兩兩比較，數據結果用平均值±標準誤(Mean±SE)進行表示，使用Spearman對LEP與生殖激素進行單側相關性分析，結果P<0.05為顯著，P>0.05為不顯著，P<0.01為極顯著。

2 結果與分析

2.1 LEP及生殖激素的標準曲線的繪制

參照LEP及GnRH、FSH、LH、E2和PROG的ELISA試劑盒說明書繪制LEP及生殖激素的標準曲線，結果如圖1～6。LEP、GnRH、FSH、LH、E2和PROG線性回歸曲線的相關系數分別是0.994、0.998、0.992、0.992、0.992和0.995，均大于試劑盒所提供的相關系數(R2>0.92)，說明此次試驗樣品的檢測結果可信。

2.2 西門塔爾牛不同組的LEP濃度的變化

由表1可知，健康組在4個時期中的LEP濃度均高于屢配不孕組的LEP濃度，且2個組隨時間的推移濃度逐漸降低。圖7顯示，健康組的LEP濃度高于屢配不孕組的LEP濃度，只有產后27 d時屢配不孕組的濃度高于健康組，此時健康組的LEP平均濃度是2.16 ng/mL，而屢配不孕組的LEP平均濃度是2.53 ng/mL。健康組在采樣期間的LEP濃度出現4個峰值，分別是產后34、52、68和85 d，屢配不孕組的LEP濃度在采樣期間出現了4個峰值，分別是產后27、34、68和85 d，兩組出現峰值的時間大體相同。

表1 不同組的瘦素濃度比較

2.3 西門塔爾牛不同分組的瘦素與生殖激素的相關性分析

由表2可知，在健康組與屢配不孕組中，LEP與GnRH、E2、PROG和LH正相關，與FSH負相關。在健康組中，LEP與GnRH和E2相關性顯著(P<0.05)，與PROG相關性極顯著(P<0.01)。在屢配不孕組中，LEP只與PROG相關性顯著(P<0.05)。

表2 西門塔爾牛健康組與屢配不孕組的瘦素與生殖激素的相關性分析

3 討 論

3.1 西門塔爾牛不同組LEP濃度的變化

LEP是由Zhang[11]等人在1994年在對遺傳性肥胖小鼠的脂肪組織進行位置克隆技術時所發現的一種蛋白質激素，在內分泌方面有著一定的作用[12]。近年來的研究發現LEP除了有調節機體脂肪的消耗儲存的能量平衡的重要作用外[13],在生殖方面也發揮著重大作用[14]。LEP可縮短性成熟的

時間，Chehab F F[5]等對正常性成熟之前的小鼠腹腔注射LEP，可明顯發現LH和E2的濃度上升，并且小鼠的陰道口明顯張開，提前進入動情期及性器官趨向成熟。LEP是青春期中早于LH、FSH出現的激素[15]。LEP在妊娠期起維持妊娠的作用。妊娠前期的LEP水平與機體內的脂肪含量高度相關，但在妊娠期，脂肪組織產生的LEP低于胎盤所產生的LEP[13]。Highman TJ[16]等研究表明在妊娠期，LEP隨妊娠時間先上升，在妊娠中期達到最高，隨后下降并保持在正常范圍內。

本試驗中，產后恢復期的LEP濃度均高于發情期中的LEP濃度，可能是因為在發情時需要的能量比較多，導致LEP的濃度低于產后恢復期的LEP濃度。健康組在配種成功后進入到妊娠期，而屢配不孕組則進入下一個發情期接著發情，直到配種成功，所以3個發情期所代表的是屢配不孕的時期分組，而健康組在第2個發情期之后就進入了妊娠期，但是從圖7看出健康組進入妊娠期的變化規律和屢配不孕組進入第3個發情期的變化規律相似，可能是在妊娠前期攝入能量所影響的LEP濃度高于胎盤產生的濃度，所以其變化規律與未妊娠的牛相似。杜旭旭[17]等研究奶牛分娩前后血清中LEP的濃度變化規律，發現奶牛產后血清中的瘦素濃度總趨勢呈波浪式下降。本文結果與杜旭旭等結果相同，在產后都是波浪式下降。產后恢復期兩組的LEP濃度都先下降，分析原因是由于西門塔爾牛在這一時期出現不同程度的能量負平衡，導致LEP濃度降低，此結果與鄭家三[18]等的結果相同，鄭家三等人研究LEP與奶牛泌乳早期能量平衡和生殖機能的關系時得出奶牛泌乳早期出現能量負平衡，產后14 d其影響最高。能量負平衡使奶牛產后干物質攝入量、體重和泌乳量減少及LEP濃度降低。

3.2 西門塔爾牛不同分組的瘦素與生殖激素的相關性分析

機體的內分泌一直是處于相對穩定的平衡狀態，各激素之間的相互作用調節著機體的一系列生理活動。生殖激素間的相互作用使得生殖得以正常發生，LEP也可由胎盤、卵巢等組織分泌，影響著生殖的調控。研究表明，LEP和生殖激素有一定的相關性，影響著生殖激素的分泌[19]。孫長顥[20]等研究表明，在女性青春期整個發育過程中，LEP水平和E2水平呈正相關(r=0.45，P<0.01)，但是在糾正了年齡因素之后，LEP和E2相關性不顯著(P>0.05)，其試驗結果與本文的結果相同，本試驗的LEP與E2水平呈正相關(P<0.05)。

本試驗中健康組和屢配不孕組的LEP與PROG的相關顯著性程度不同，與健康組相關性極顯著，與屢配不孕組相關性顯著，說明屢配不孕組的LEP對PROG的合成及分泌的影響沒有健康組的影響大，由此可推斷低濃度的LEP可能影響西門塔爾牛屢配不孕的原因是影響了PROG的合成與分泌。陳正瓊[21]等對妊娠期糖耐量異常患者血清的E2、PROG、PRL與LEP水平的關系進行研究，表明LEP只與PROG相關(r=0.321，P<0.01)，而與PRL和E2的相關性不顯著(P>0.05)，與本文的試驗結果相同，說明本文的數據結果可以用來說明LEP與PROG的關系。

LEP與FSH呈負相關，與LH呈正相關，LEP與兩種激素的差異性均不顯著(P>0.05)，說明LEP對FSH和LH的合成可能有影響，但沒有統計學意義。體外培養研究發現，LEP可以促進大鼠腺垂體FSH和LH的合成與分泌，還可以促進小母豬的LH的合成與分泌，說明LEP可以作用于垂體組織來影響FSH和LH的濃度[22]。研究表明，給小鼠注射LEP，可發現FSH的濃度顯著低于未注射LEP時的濃度，說明LEP對FSH的合成與分泌具有副作用，與本文的結果相同，表明本試驗的結果正確[23]。

4 結 論

屢配不孕組的LEP濃度低于健康組的LEP濃度，因此，LEP可能會影響西門塔爾牛屢配不孕，為預防及治療生產中牛屢配不孕提供相關參考。LEP與屢配不孕組的PROG呈正相關(P<0.05)，說明LEP可能影響PROG的合成及分泌，LEP濃度增多可促進PROG的分泌，為之后研究LEP與牛屢配不孕生殖激素之間的相關性提供參考。