夷陵山羊微衛(wèi)星標記雜合度與生長性狀的回歸關系

鄧云霏，付玉蓉，沈洪學，劉桂瓊，朱德江，張 敏,，姜勛平*

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，湖北 武漢 430070;2. 宜昌市畜牧獸醫(yī)中心，湖北 宜昌 443000; 3. 宜昌市畜牧技術推廣站，湖北 宜昌 443000)

【研究意義】雜合度-適合度相關現(xiàn)象(Heterozygosity-fitness correlations，HFCs)在許多物種中已有發(fā)現(xiàn)，這些性狀包括體重、存活率和發(fā)育穩(wěn)定性等性狀。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)個體雜合度與生長性狀呈顯著正相關[1-6]。近交和遺傳漂變會降低遺傳雜合度，低雜合度會降低適應性，從而導致雜合度與適合度相關[7]。雜合度可能是通過個體發(fā)育和生命早期最重要的環(huán)境之間的相互作用，即可能的生存能力選擇對動物產(chǎn)生影響[8]。局部效應假設和一般效應假設認為，雜合度-適合度的相關性來自聯(lián)合超顯性，即受中性選擇的微衛(wèi)星標記與選擇位點之間的遺傳關聯(lián)產(chǎn)生的表觀雜合子優(yōu)勢[9]。【前人研究進展】個體多位點雜合度(Multilocus heterozygosity，MLH)是雜合子位點占所有測定位點的比值，其值越高說明近期系譜中的近交程度越低。Coulson等[1]假設微衛(wèi)星標記的突變主要通過重復單位數(shù)量的逐步變化而發(fā)生變異，并據(jù)此提出用個體2個等位基因之間重復單位的平方距離(meand2，MD)作為衡量近交程度的指標。該方法基于逐步突變過程，適用于微衛(wèi)星遺傳標記[10]。MD是由單個個體在一個基因座上的2個等位基因計算的，是對形成個體的配子之間遺傳距離的度量。MD記錄純合性，但對于擁有數(shù)個等位基因的微衛(wèi)星，等位基因長度變異的貢獻可能掩蓋了純合性的貢獻。因此，MD一般包含比個體雜合度更深層和久遠的遺傳事件。MD是衡量近交程度的有用指標，在衡量近期育種模式的結果時，它與更遙遠的事件有關[6]。MLH反映近期事件造成的個體遺傳變異，MD反映遠期事件造成的個體遺傳變異。【本研究切入點】夷陵山羊是地方肉用山羊品種，分布在中國的三峽地區(qū)(TGA)。三峽地區(qū)眾多的河流與溝壑劃分出一系列相互獨立的區(qū)域，在這里逐漸形成豐富的山羊品種資源。雜種優(yōu)勢在現(xiàn)代畜牧生產(chǎn)中受到廣泛應用，雜合度-適合度的相關性研究在動物生產(chǎn)中具有重要價值。若在群體中存在正回歸關系，則應采用育種方法提高個體雜合度。【擬解決的關鍵問題】確定夷陵山羊MLH、MD與生長性狀、體重-體長指數(shù)之間的關系；比較MLH與MD2種指標在衡量近交程度上的差異，探索夷陵山羊體重是受近期還是遠期變異的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采集5個三峽地方品種共269只山羊的血液樣品，包括夷陵山羊(YL，n=37)、宜昌白山羊(YW，n=52)、麻城黑山羊(MB，n=60)、酉州烏羊(YB，n=60)和烏骨山羊(BB，n=60)，提取基因組DNA用于SNP測序，分析夷陵山羊與其他4種山羊的遺傳分化。5個山羊品種主產(chǎn)區(qū)均分布于長江三峽地區(qū)沿岸。

采集247只夷陵山羊的血液樣品，均為2歲及2歲以上的成年母羊，提取基因組DNA用于微衛(wèi)星測序，分析微衛(wèi)星雜合度與生長性狀的關系。樣本分別來自長陽永興生態(tài)牧業(yè)科技有限公司(n=63)、宜昌老高荒生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司(n=114)和秭歸縣兩河口鎮(zhèn)宋春雷山羊養(yǎng)殖家庭農(nóng)場(n=70)，以上3個核心保種場飼養(yǎng)管理方式與營養(yǎng)水平一致。測定每只羊的體長、體高、胸圍和體重，體重體尺測定參照農(nóng)業(yè)部標準《綿、山羊生產(chǎn)性能測定技術規(guī)范》(NY/T 1236-2017)中的方法測定。

1.2 SNP測序分型

根據(jù)標準苯酚-氯仿法提取基因組DNA，溶解于TE緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)]中，并于-20 ℃儲存。選擇來自山羊的7條染色體的14個SNP標記，每個基因座的引物和基因分型方法如表1所示。

表1 14個SNP位點的引物序列、退火溫度及基因分型方法

續(xù)表1 Continued table 1

1.3 微衛(wèi)星測序分型

從GenBank和FAO公布的數(shù)據(jù)以及前人研究中[11]，挑選7個山羊通用微衛(wèi)星位點。用熒光標記引物對各位點進行PCR擴增，毛細管電泳法進行測序分型(昆泰銳公司進行)。PCR擴增條件為95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，退火20 s，72 ℃延伸10 s，從變性到延伸共進行35次循環(huán)。微衛(wèi)星位點信息、退火溫度如表2所示，PCR反應體系如表3所示。

表2 7個微衛(wèi)星位點的引物序列和退火溫度

表3 7個微衛(wèi)星位點的PCR反應體系

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 體重-體長指數(shù)計算 計算3種體重-體長指數(shù)：G指數(shù)(Gindex，IG)、體質(zhì)指數(shù)(Body massindex，IBM)和體重指數(shù)(Ponderal index，IP)。

IG計算公式[12]：

IG=BW/BL1.5

(1)

式中，BW為體重，BL為體長。

IBM計算公式[13]：

IBM=BW/BL2

(2)

式中，BW為體重，BL為體長。

IP計算公式[14]：

IP=BW/BL3

(3)

式中，BW為體重，BL為體長。IP參考人類新生兒的體重-身高指數(shù)。

1.4.2 個體雜合度計算 用Excel計算個體的多位點雜合度(MLH)和等位基因距離平方均值(MD)。

個體多位點雜合度指n個位點上雜合位點數(shù)占總位點數(shù)的比值，計算公式如下：

MLH=Hi/n

(4)

式中，Hi是雜合位點數(shù)，n是所有位點數(shù)。

等位基因距離平方均值指個體n個位點上等位基因大小之差的平方和平均值，計算公式[1]如下：

(5)

式中，ia和ib是位點i上等位基因a和b重復單位的長度，n為個體計分的位點總數(shù)。

1.4.3 群體遺傳參數(shù)分析 用Genepop計算5個山羊品種之間的Nei氏遺傳距離，并用Mega v.10.0.5的Neighbor-Joining方法構建系統(tǒng)發(fā)生樹。用POPGENE計算7個微衛(wèi)星位點的群體觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)，用PIC_CALC計算多態(tài)信息含量(PIC)。

用SAS v9.4的GLM過程對MLH、MD與性狀、體重-體長指數(shù)進行回歸分析。為了提高正態(tài)性，對MD取對數(shù)值[lg(d2+1)][15]，并以該值進行后續(xù)分析。為了避免生長性狀與雜合度兩者間度量尺度差異過大導致的統(tǒng)計效力下降，對體長、體高、胸圍和體重取對數(shù)值。該過程不會改變數(shù)據(jù)間的性質(zhì)與相關關系，通過取對數(shù)壓縮了變量尺度，以達到提高統(tǒng)計效力的目的。

2 結果與分析

2.1 品種間的親緣關系聚類

根據(jù)Nei氏遺傳距離，用Neighbor-Joining方法構建5個山羊品種的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)。夷陵山羊和宜昌白山羊先聚為一類，再與酉州烏羊聚為一類，烏骨山羊和麻城黑山羊則單獨聚為一類。

2.2 夷陵山羊體重體尺及其指數(shù)多樣性

夷陵山羊成年體重變異范圍較大(表4)，大于1倍標準差的比例是15.8%，大于2倍標準差的比例是1.2%。體尺、體重-體長指數(shù)也表現(xiàn)出相似的特點，表明該群體包含豐富的遺傳變異。

表4 夷陵山羊體重、體尺及其指數(shù)的平均數(shù)、標準差和變異范圍

2.3 夷陵山羊群體遺傳標記多樣性

夷陵山羊7個微衛(wèi)星位點的平均等位基因數(shù)為8.6(表5)，等位基因座數(shù)量變異范圍是6～10。夷陵山羊均顯示出雜合性，7個位點的雜合度平均值為0.631，變異范圍為0.360～0.837。期望雜合度平均值為0.672，變異范圍為0.546～0.759。

7個位點的多態(tài)信息含量均值為0.615，除位點INRABERN172的PIC值為0.441，其余位點的均大于0.5，表明具有較豐富的遺傳變異信息(表5)。

表5 夷陵山羊7個微衛(wèi)星位點的雜合度和多態(tài)信息含量

2.4 夷陵山羊的MLH、MD與生長性狀、體重-體長指數(shù)的回歸關系

夷陵山羊4個生長性狀與3個體重-體長指數(shù)中，體重與MD存在顯著的回歸關系(P<0.05，表6和圖2)，回歸方程表示為lg(WT)=0.03354lg(d2+1) + 1.403，MD可解釋1.72%的體重變異。IG、IBM和IP分別與MD存在顯著的回歸關系(P<0.05)，回歸方程分別表示為IG=8.32lg(d2+1) + 54.87，IBM=12.58lg(d2+1) + 70.83和IP=27.25lg(d2+1) + 120.4，MD可解釋2.88%的IG變異，2.75%的IBM變異和2.34%的IP變異夷陵山羊MLH、MD與生長性狀和體重-體長指數(shù)的回歸曲線擬合度均較低(R2<0.1)。在其他物種的相關研究中，體重與雜合度回歸曲線的擬合度均低于0.1(R2<0.1)[6]，說明在微衛(wèi)星雜合度與適應性性狀相關性研究中其擬合度較低屬于普遍現(xiàn)象，與數(shù)據(jù)的對數(shù)轉(zhuǎn)換無關。

表6 夷陵山羊MLH、MD與生長性狀和體重-體長指數(shù)的單因素回歸分析結果

3 討 論

3.1 夷陵山羊與相鄰4種山羊的遺傳差異

夷陵山羊與其余4種山羊存在遺傳差異。首先，夷陵山羊與宜昌白山羊先聚為一類。夷陵山羊主產(chǎn)區(qū)位于湖北宜昌，含有50%宜昌白山羊血緣、25%波爾山羊血緣和25%努比山羊血緣，此結果符合夷陵山羊的培育歷史。其次，與夷陵山羊遺傳距離較近的是酉州烏羊，最遠的是麻城山羊和烏骨山羊。聚類結果與各山羊品種主產(chǎn)區(qū)的地理分布情況基本相符，這與三峽地區(qū)特殊的地理環(huán)境有關[16]。地理隔離是群體間基因交流的天然屏障[17]，盡管5種山羊的產(chǎn)地集中，地理距離相對較小，但三峽地區(qū)河流與溝壑眾多，將此處的山羊群體劃分至破碎的小生境中，加上各地交通不便，各個山羊群體之間幾乎沒有基因交流。上述條件使得分布在此處的山羊小群體產(chǎn)生分化，逐漸形成豐富的地方山羊品種。因此，夷陵山羊是獨立于其他4種山羊的品種。

3.2 夷陵山羊體重與MD的關系

夷陵山羊體重與用微衛(wèi)星標記估測的MD間有顯著回歸關系(P<0.05)，而體長、體高和胸圍與MD沒有顯著回歸關系(P>0.05)。在馬鹿、斑海豹中發(fā)現(xiàn)初生重與MD之間存在正回歸關系(P<0.05)[1, 18]。

Han等[19]在通山烏骨山羊中觀測到體重、體長、體高、胸圍和管圍等性狀與MLH具有顯著回歸關系(R2=2.51%～3.68%,P<0.05)。在鼠[2]、豬[3-4]、歐洲鰻鱺[5]和雞[6]等物種中，也觀測到雜合度與體重、生長速率等適應性性狀存在正回歸關系。由此可知，個體雜合度與體重等性狀具有普遍的回歸關系。但在本研究中，夷陵山羊體重與MLH間沒有顯著回歸關系(P>0.05)。MLH與MD是衡量個體遺傳多樣性的兩種不同指標，有關2種指標的相互補充與區(qū)別需進一步探討。

3.3 夷陵山羊體重-體長指數(shù)與MD的關系

夷陵山羊IG、IBM、IP與MD間有顯著回歸關系(P<0.05)。未見其他MD與體重-體長指數(shù)關系的相關研究報道。

IG是由Gootwine[11]提出的一個新的體重-體長指數(shù)，專為綿羊而設計。IBM的含義是單位體表面積的平均體重。IBM是衡量動物機體能量儲備的一個良好指標[20-23]。IBM包含體重和體型信息，與背膘厚、背最長肌和產(chǎn)奶量等營養(yǎng)狀況性狀的正相關表明IBM具有附加屬性[24]。IP的含義是單位體積的平均體重，相當于機體密度的度量。目前在山羊上還未見關于IG、IBM、IP與MD之間關系的研究。實際上IG、IBM與IP都包含有體重和體型信息，它們與MD的正相關也說明雜合度高的個體在機體能量儲備方面比雜合度低的更具優(yōu)勢。

3.4 夷陵山羊MLH與MD結果之間的對比

MLH與MD是有效衡量近交程度的指標，MLH反映近期事件造成的個體遺傳變異，MD反映遠期事件造成的個體遺傳變異。

夷陵山羊的體重與MD間有顯著回歸關系(P<0.05)，但沒有發(fā)現(xiàn)與MLH相關性(P>0.05)。MLH是雜合子位點占所有測定位點的比例，MD是形成個體的配子之間遺傳距離的度量，MD相比MLH包含更多的種群歷史信息。盡管有研究認為MLH比MD更適合作為雜合度-適合度相關性研究的遺傳指標，但當種群存在群體統(tǒng)計學歷史，或種群中所有個體都高度雜合時，同時使用這2種指標可能對進化過程的深入分析有所幫助，因此更傳統(tǒng)的雜合度測量方法無法區(qū)分個體間差異[25]。Coltman等[18]認為，對于微衛(wèi)星標記數(shù)據(jù)，MD比MLH更適用于衡量自然群體中的個體遺傳變異。夷陵山羊是人工培育品種，其父系血統(tǒng)來自波爾山羊與努比山羊，母系血統(tǒng)來源于宜昌白山羊。波爾山羊是人工培育品種，努比山羊是從國外引進后經(jīng)過本土化的人工培育品種，宜昌白山羊是經(jīng)過長期選育的本土品種。夷陵山羊具有50%的宜昌白山羊血統(tǒng)。因此，本研究結果顯示夷陵山羊的體重與MD的關系可能遺傳于其母系品種宜昌白山羊的長期自然與人工選擇事件的結果。

在本研究中，夷陵山羊的IG、IBM、IP與MD間有顯著回歸關系(P<0.05)，但與MLH沒有相關性(P>0.05)。Gibbs與Chiucchi[26]對14個響尾蛇群體的研究表明，在13個群體中個體體質(zhì)(以Scaled mass index衡量)與MLH沒有相關性，僅有1個群體結果顯著。IBM和IP是反映體型的體況指標。本研究的結果提示夷陵山羊的體型的個體間差異可能并非由近期發(fā)生的近交產(chǎn)生，而是由遠期遺傳變異事件造成基因組層面上的變異產(chǎn)生的，這可能要追溯到夷陵山羊品種形成之前的時期，即群體遺傳分化。營養(yǎng)儲備能力影響動物生存能力，由于IG、IBM與IP能在一定程度上反映營養(yǎng)儲備能力，在適宜范圍內(nèi)，其值越大，個體具有更高的適應能力。IG、IBM和IP在衡量家養(yǎng)群體的個體遺傳變異時具有各自的優(yōu)點，在評估近交程度時可相互補充。

4 結 論

夷陵山羊的體重與MD之間存在顯著的正回歸關系，說明其體重變異可能是遺傳于其母系品種宜昌白山羊的長期適應性進化的結果。夷陵山羊的IG、IBM、IP與MD之間存在顯著的回歸關系，即體型在一定程度上受遠期遺傳變異事件的影響。

致 謝：感謝宜昌市畜牧獸醫(yī)中心與華中農(nóng)業(yè)大學肉羊繁育課題組的劉辰暉、種玉晴、許鋒等人在采樣時給予的幫助。感謝長陽永興生態(tài)牧業(yè)科技有限公司、宜昌老高荒生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司和秭歸縣兩河口鎮(zhèn)宋春雷山羊養(yǎng)殖家庭農(nóng)場工作人員的支持。