IL-22調(diào)控EAM小鼠心肌纖維化的初步研究①

陳 嘉 陳 蓉 曹毓文 夏 琳 劉 芳 蘇兆亮

（江蘇大學(xué)國際基因組學(xué)研究中心，鎮(zhèn)江212013）

心臟纖維化是心臟疾病晚期常見的病理改變［1-2］。心臟纖維化的主要標(biāo)志是成纖維細(xì)胞向纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，基質(zhì)分泌和降解不平衡［3］。在纖維化瘢痕的晚期階段，膠原蛋白大量分泌，膠原蛋白通過基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）進(jìn)行蛋白水解，形成穩(wěn)定的纖維［4-5］。MMPs受金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）負(fù)調(diào)控［6-7］。研究表明心臟在遭受刺激時，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS）被激活，釋放的血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，ANGⅡ）直接或間接刺激TGF-β的產(chǎn)生，充當(dāng)了心臟成纖維細(xì)胞的刺激劑［8-11］。由于心臟纖維化疾病的治愈率低，致死率高，所以積極尋找治療心臟纖維化的可能靶點(diǎn)一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）小鼠的心肌炎是由心肌球蛋白肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的心臟損傷，當(dāng)EAM發(fā)展到后期，小鼠心臟就會發(fā)展至纖維化［12-13］。

IL-22是IL-10家族成員，具有抗炎和促炎兩方面的作用［14-15］。IL-22主要由免疫細(xì)胞分泌，如：Th17、Th22以及固有淋巴細(xì)胞等［16-17］。近年來，IL-22被認(rèn)為在心臟當(dāng)中具有保護(hù)作用［18］。然而，IL-22在心臟纖維化中的作用尚不完全清楚。本研究旨在通過研究IL-22對心臟纖維化以及TGF-β/Smad3信號通路的影響，探討IL-22抑制心臟纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 α-SMA、β-actin、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（Abcam，美國）；CollagenⅠ、Smad3、P-samd3（CST，美國）；ELISA kit（聯(lián)科生物，中國）。

1.2 方法

1.2.1 Western blot檢測α-SMA、CollagenⅠ及PSmad3的表達(dá) 小鼠心肌成纖維細(xì)胞株計數(shù)后按照細(xì)胞數(shù)量2.5×105個/孔均勻地種入24孔板中，檢測α-SMA及CollagenⅠ表達(dá)時，設(shè)置對照組，ANGⅡ組（ANGⅡ處理12 h），IL-22+ANGⅡ組（IL-22預(yù)處理12 h后ANGⅡ處理12 h）。檢測IL-22對信號通路的影響時，IL-22預(yù)處理成纖維細(xì)胞12 h后，ANGⅡ處理5 min。RIPA裂解提取各組總蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜，封閉后，加入按照說明書預(yù)先稀釋好的一抗（α-SMA、CollagenⅠ、β-actin、Smad3及P-Smad3），4℃孵育過夜。TBST清洗后孵育對應(yīng)的二抗，室溫1 h；TBST清洗后顯影。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光染色 細(xì)胞種于預(yù)先放置好爬片的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入相應(yīng)的刺激劑。培養(yǎng)結(jié)束后，PBS清洗后依次經(jīng)歷0.1%Triton破膜，5%BSA封閉，預(yù)先稀釋的一抗4℃冰箱過夜孵育，對應(yīng)的熒光二抗避光、室溫孵育，DAPI染色，清洗后使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.3 ELISA法檢測TGF-β、ANGⅡ表達(dá) 按照ELISA kit說明書完成對細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TGF-β、小鼠血清中ANGⅡ含量的檢測。

1.2.4 天狼星紅染色 4%多聚甲醛固定心臟組織，常規(guī)石蠟包埋切，4μm厚片。切片二甲苯和梯度酒精脫去石蠟后，Weigert鐵蘇木素染色20 min，用流水沖洗10 min，天狼星紅染色液室溫滴染1 h。用流水稍沖洗切片，去除表面的染色液。最后脫水透明，再用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.5 qRT-PCR 按照酚-氯仿法提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的轉(zhuǎn)錄方法獲得cDNA，以cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR，檢測CollagenⅠ/Ⅲ的表達(dá)。

1.2.6 重組IL-22蛋白表達(dá)、純化 將公司構(gòu)建的IL-22表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)后，將重組IL-22菌體收集、離心后，進(jìn)行超聲波破碎菌體并留取部分總菌液，剩下的菌液離心后分別收集上清與沉淀。將總菌液、上清與沉淀利用凝膠電泳檢測重組IL-22的表達(dá)形式。由于重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，所以在誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的過程中易于形成不溶解的包涵體，將包涵體進(jìn)行變性及復(fù)性后獲取可溶性的重組IL-22溶液。可溶性IL-22溶液經(jīng)過鎳柱親和層析純化后，獲得純度較高的IL-22蛋白，去除內(nèi)毒素，BCA測定所獲得蛋白的濃度。

1.2.7 動物實(shí)驗(yàn) 抗原肽制備：1 mg豬心肌球蛋白MyHC-α614-629（Ac-SLKLMATLFSTYASADOH）溶于1 ml PBS溶液中，與弗氏完全佐劑按照1∶1的比例混合，將試劑置于冰上研磨至油包水狀態(tài)。BALB/c 6周齡小鼠分為對照組、EAM模型組、IL-22+EAM治療組。對照組皮下注射PBS；EAM模型組和IL-22+EAM治療組在第0天、第7天皮下注射抗原肽構(gòu)建模型，IL-22+EAM治療組在第14天開始尾靜脈注射IL-22（300 ng/g），每隔1 d注射1次，直至28 d，處死小鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，兩兩之間比較運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組IL-22蛋白的表達(dá)和純化 凝膠電泳結(jié)果顯示，重組IL-22蛋白在15～25 kD之間有明顯條帶，并且主要存在于沉淀中，即以包涵體形式表達(dá)（圖1A）。將包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性后的凝膠結(jié)果顯示，部分重組蛋白在復(fù)性后轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘鞍祝▓D1B）。重組IL-22可溶性蛋白溶液進(jìn)行純化后可得到的純度較高的蛋白（圖1C）。將得到的重組蛋白進(jìn)行BCA蛋白濃度測定，測得重組IL-22蛋白濃度為131 mg/ml。

圖1 重組IL-22的表達(dá)及純化Fig.1 Expression and purification of recombinant IL-22

2.2 IL-22對ANGⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膠原及α-SMA表達(dá)的影響 Western blot和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，IL-22+ANGⅡ處理后，與ANGⅡ處理組相比，Collagen和α-SMA的表達(dá)量下降（圖2A、B）。qRT-PCR顯示，與ANGⅡ組相比，IL-22+ANGⅡ組CollagenⅠ/Ⅲ的mRNA表 達(dá) 量 下 降（P＜0.01，圖2C）。

圖2 IL-22對ANGⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膠原及α-SMA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of IL-22 on expressions of collagen andα-SMA in myocardial fibroblasts induced by ANGⅡ

2.3 IL-22對ANGⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞TGF-β表達(dá)水平及下游信號通路的影響 ELISA結(jié)果顯示，IL-22+ANGⅡ組與ANGⅡ組相比，TGF-β表達(dá)量降低（P＜0.01，圖3A）。Western blot檢測信號分子Smad3的磷酸化水平，結(jié)果顯示ANGⅡ激活Smad3信號通路，但I(xiàn)L-22處理后Smad3磷酸化水平被抑制（圖3B、C）。

圖3 IL-22對ANGⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞TGF-β表達(dá)水平及下游信號通路的影響Fig.3 Effect of IL-22 on expression level of TGF-βand downstream signaling pathways induced by ANGⅡin myocardial fibroblasts

2.4 重組IL-22干預(yù)后抑制了EAM小鼠晚期的纖維化 在誘導(dǎo)EAM模型后第21天和28天處死小鼠，摘取心臟，HE染色觀察炎癥浸潤情況。結(jié)果顯示，EAM小鼠21 d時炎癥浸潤程度最高，而28 d時炎癥浸潤程度減少（圖4A）。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EAM模型在28 d時開始出現(xiàn)心臟纖維化的現(xiàn)象。ELISA結(jié)果顯示，IL-22注射治療后ANGⅡ表達(dá)量與EAM28天組相比明顯減少（P＜0.05，圖4B）。qRT-PCR結(jié)果顯示，IL-22注射后CollagenⅠ/Ⅲ表達(dá)與EAM 28 d相比表達(dá)量降低（P＜0.001，圖4C）。天狼星紅染色結(jié)果顯示，IL-22注射組的紅色區(qū)域（膠原沉積部分）較EAM 28 d組減少，表明心臟纖維化被有效緩解（圖4D）。

圖4 重組IL-22干預(yù)后抑制EAM小鼠晚期的纖維化Fig.4 Interfering with recombinant IL-22 inhibits fibrosis in EAM mice

3 討論

在心臟受損、穩(wěn)態(tài)水平被破壞時，心臟基質(zhì)重塑并導(dǎo)致心臟功能下降，最終發(fā)展為心臟纖維化［19］。心臟纖維化的主要表現(xiàn)是膠原沉積、肌成纖維細(xì)胞向纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)換以及肌成纖維細(xì)胞的增殖，心臟的順應(yīng)性降低且收縮和舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭和死亡［20］。因此，找到能逆轉(zhuǎn)心臟纖維化發(fā)展的因素或藥物迫在眉睫。當(dāng)RAAS系統(tǒng)被激活后，ANGⅡ可以通過直接作用或者TGF-β介導(dǎo)的作用引起纖維化［21］。本實(shí)驗(yàn)表明IL-22通過抑制由ANGⅡ引起的TGF-β上調(diào)，從而抑制了成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。

近年研究表明，在器官纖維化的常見關(guān)鍵介質(zhì)中，IL-10細(xì)胞因子家族凸顯出了重要作用，IL-22作為IL-10家族的一員，因?yàn)榕c組織重塑相關(guān)而受到關(guān)注［22］。在已有的研究中表明，IL-22在心臟纖維化中具有保護(hù)作用，但是通過何種方式具有保護(hù)作用尚未研究清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-22通過抑制TGF-β下游的Smad3信號通路，阻斷了成纖維細(xì)胞的活化。

綜上所述，IL-22可以抑制TGF-β/Smad3的信號阻止成纖維細(xì)胞向纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，緩解了EAM小鼠心肌纖維化的進(jìn)程。