沙眼衣原體Ⅲ型分泌系統效應蛋白CT143保護小鼠抵抗衣原體生殖道感染①

楊春芬 廖文彥 任 林 唐雙陽 陳 慧 陸春雪（南華大學附屬第一醫院婦產科，衡陽421001）

沙眼衣原體（Chlamydiatrachomatis，Ct）是全球范圍內細菌性性傳播疾病的首位病因［1］。其對抗生素治療敏感，但由于絕大多數生殖道感染患者起病隱匿，無明顯自覺癥狀而不能進行及時有效的治療，導致上行感染并引發盆腔炎、不孕不育等嚴重并發癥［2］。育齡期婦女是衣原體生殖道感染的高發人群，大量醫療費用被用于衣原體感染及相關并發癥的治療，因此全社會迫切呼吁有效的抗衣原體疫苗。Ct是嚴格真核細胞內寄生的革蘭氏陰性細菌，根據其組織嗜性不同被劃分為4種生物型，包括主要感染人類眼結膜上皮細胞的沙眼生物型，引起人類泌尿生殖道上皮細胞感染的生殖道生物型，可引起全身性感染的性病淋巴肉芽腫生物型，及引起小鼠肺炎和生殖道感染的鼠生物型，即鼠衣原體（C.muridarum，Cm）［3］。由于Ct生殖道生物型感染的自然宿主為人，在小鼠體內不能導致明顯的生殖道病變，而Ct鼠生物型（即Cm）陰道接種小鼠引起的上生殖道病變，如輸卵管炎、輸卵管積水、擴張和不孕等，與女性Ct生殖道生物型感染后的臨床病理過程極為相似，因此Cm小鼠生殖道感染模型被廣泛用于Ct致病機制及免疫學研究［4］。研究者已經通過Cm感染的小鼠模型證實，Th1型細胞免疫應答及細胞因子IFN-γ在抗衣原體感染過程中發揮至關重要的作用［5-6］。

本課題組前期從Ct D標準株D/UW-3/CX基因組成功擴增出Ⅲ型分泌系統（TypeⅢsecretion systems，T3S）效應蛋白CT143的全長編碼基因，并在原核系統實現高效表達及純化［7］，本實驗進一步采用小鼠Cm生殖道感染模型，初步評價CT143蛋白的疫苗保護性作用及相關的免疫機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡雌性近交系BALB/c小鼠，體重18～22 g，動物許可證號：SYXK（湘）2020-0002，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，由南華大學實驗動物部飼養，相關實驗動物操作均符合南華大學實驗動物管理委員會的倫理學規定。

1.1.2 菌株及試劑 Cm標準株Nigg由南華大學病原生物學研究保存；CT143蛋白由本研究所純化并保存；免疫佐劑CpG購自美國Pharmingen公司；小鼠血清抗體IgG及亞類IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3檢測試劑盒購自上海生工生物工程公司；細胞因子IFN-γ和IL-5檢測試劑盒及Cy2標記的羊抗兔二抗均購自美國eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫小鼠 45只雌性BALB/c小鼠隨機分為CT143重組蛋白免疫組、CT143+CpG免疫組及CPG佐劑對照免疫組，15只/組。小鼠經3%異氟醚輕度麻醉后，分別于第0天、第14天和第28天接受滴鼻免疫。CT143+CpG組小鼠每次免疫的CT143蛋白和CpG佐劑劑量分別為30μg和10μg，其他兩組小鼠僅接受CT143蛋白或CpG佐劑免疫。

1.2.2 血清抗體檢測 最后1次加強免疫后20 d，對小鼠（5只/組）實施安樂死，收集血液，分離血清，測量抗體水平。ELISA酶標板用重組CT143蛋白包被（1μg/孔），4℃吸附過夜。將血清從1∶100倍比稀釋至1∶12 800，加入反應板孵育2 h、0.05%PBST洗滌3次后，以HRP標記的山羊抗小鼠總IgG為二抗，ABTS為顯色劑，酶標儀測定405 nm處吸光度（OD值）。將CT143免疫組及CT143+CpG免疫組的小鼠血清分別進行1∶800倍稀釋，進一步以HRP標記的山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗體為二抗，檢測IgG亞類。

1.2.3 細胞因子檢測 最后1次加強免疫后20 d，對小鼠（5只/組）實施安樂死，收集脾臟，并制作單細胞懸液。用含10%胎牛血清的細胞培養基RPMI1640調整脾細胞數為5×106個/ml，1 ml/孔加入24孔細胞培養板，以不加抗原的培養基（medium）、10μg BSA或10μg CT143抗原體外刺激3 d，收集上清，按照細胞因子IFN-γ和IL-5檢測試劑盒說明書，ELISA法檢測405 nm處OD值，根據制備的標準曲線，計算各樣本的細胞因子濃度，以ng/ml表示。

1.2.4 小鼠陰道感染及下生殖道脫落上皮的衣原體含量檢測 末次免疫后25 d，每只小鼠皮下注射2.5 mg Depo-provera，同步化月經周期并增加小鼠對衣原體的易感性；5 d后，用20 ml衣原體溶液（含2×104IFUs）陰道感染小鼠。為檢測小鼠下生殖道脫落上皮細胞中的衣原體含量，每隔4 d取陰道拭子接種體外培養的單層HeLa細胞，37℃孵育24 h；細胞經甲醛固定及透化處理后，以兔抗衣原體EB為一抗、Cy2標記的羊抗兔為二抗，熒光顯微鏡下計數衣原體包涵體形成單位（inclusion forming units，IFUs），將IFUs進行log10 IFUs對數轉換后，再計算每組在每個時間點的log10 IFUs均值及標準差。

1.2.5 小鼠上生殖道的病理評估 小鼠陰道感染衣原體60 d后進行安樂死，并分離完整生殖道（含陰道、子宮頸、子宮角、輸卵管及卵巢），拍照記錄后立即放入10%甲醛中固定。樣本經石蠟包埋處理后，以5μm/張縱向連續切片（每切3次，保留1張）5張。切片經H&E染色后，觀察其組織結構及炎癥細胞浸潤情況。

1.3 統計學處理 采用方差分析比較各組小鼠下生殖道脫落上皮的衣原體含量，用成對樣本的t檢驗比較組間的抗體水平及細胞因子水平，結果以±s表示。所有數據均采用SPSS13.0軟件進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗CT143特異性體液免疫應答 CT143+CpG免疫組血清總IgG水平在各稀釋度下，均明顯高于不添加佐劑的CT143免疫組，CpG佐劑對照組不產生針對CT143的特異性抗體；在1∶800倍血清稀釋度下，CT143+CpG免疫組IgG2a的OD值為1.22±0.04，CT143免疫組IgG2a的OD值為0.43±0.03，兩組間差異有統計學意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 免疫組小鼠血清抗CT143特異性IgG抗體滴度及亞類Fig.1 Titers and subclasses of anti-CT143 specific IgG antibody in serum of immunized group mice

2.2 CT143+CpG免疫組小鼠產生特異性Th1型細胞免疫應答 如圖2所示，CT143+CpG免疫組小鼠脾細胞體外受CT143重組蛋白刺激，產生的Th1型細胞因子IFN-γ較CT143免疫組顯著升高，產生的Th2型細胞因子IL-5較CT143免疫組顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；CpG佐劑對照組脾細胞受CT143重組蛋白刺激后，其IFN-γ和IL-5分泌水平較刺激前無明顯變化。

圖2 各免疫組小鼠細胞因子IFN-γ和IL-5的產生Fig.2 Production of IFN-γand IL-5 in mice of each immunized group

2.3 CT143+CpG免疫組最早清除下生殖道感染的衣原體 小鼠陰道接種衣原體后，每隔4 d取陰道拭子，檢測拭子脫落上皮細胞中衣原體的含量，監測下生殖感染的清除情況。感染后第4天，各組脫落細胞的衣原體含量均在1×105IFUs以上，高于陰道接種劑量，且各組間無顯著差異，提示各組小鼠感染較均一、衣原體成功定植下生殖道。感染后第12、16、20天，CT143免疫組和CT143+CpG免疫組檢出量較CpG佐劑對照組明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；感染后24 d，CT143+CpG免疫組的所有小鼠下生殖道脫落細胞均無衣原體檢出，而CT143免疫組及CpG免疫組持續排菌24 d或28 d以上（圖3）。

圖3 各免疫組小鼠感染衣原體后下生殖道脫落上皮中的衣原體含量Fig.3 Chlamydia titres in exfoliated epithelium of lower reproductive tract of immunized mice following Chlamydia challenge

2.4 CT143+CpG免疫組小鼠上生殖道病理改變最輕 肉眼觀察發現，各組小鼠陰道、子宮頸、子宮角及卵巢均無明顯病變，但輸卵管出現不同程度的積水。其中CT143免疫組和CT143+CpG免疫組積水主要見于單側，且積水程度明顯低于CpG佐劑對照組。病變的輸卵管組織經HE染色鏡檢發現，CpG佐劑對照組管壁增厚，黏膜皺襞減少，頂部纖毛消失，伴有纖維組織增生及炎癥細胞浸潤；CT143+CpG免疫組小鼠輸卵管結構較清晰，管腔稍有水腫，但炎癥細胞浸潤少，且皺襞及纖毛結構完整；CT143免疫組的病理程度介于其他兩組之間（圖4）。

圖4 各免疫組小鼠感染衣原體后的上生殖道病理改變Fig.4 Pathological changes of upper reproductive tract of immunized mice following Chlamydia challenge

3 討論

Ct生殖道感染嚴重影響我國優生優育政策推行。Ct感染的臨床癥狀不典型，因此疫苗接種被認為是最理想的預防措施。然而到目前為止，仍無有效疫苗問世［8］。Ct全菌免疫可在一定程度上阻斷衣原體感染，但部分全菌接種患者在隨后的感染中，出現了更嚴重的免疫病理反應，提示全菌疫苗包含致敏成分［9］。目前，Ct疫苗研究主要集中于亞單位疫苗，Ct主要外膜蛋白、包涵體膜蛋白IncA、Ct蛋白酶樣活性因子等亞單位疫苗免疫均能提供部分保護作用［10-12］。衣原體以原體形式感染，在宿主細胞包涵體內轉變為始體，以始體形式增殖，最后轉變為原體釋放，感染更多細胞。由于衣原體感染周期復雜，單一亞單位疫苗難以發揮全面保護作用，制備Ct聯合亞單位疫苗以期從黏附、定植、增殖、釋放等環節全面阻斷衣原體感染是疫苗研究的重要方向，尋找更多Ct疫苗候選抗原是衣原體研究的長期目標。

在與宿主細胞的相互作用過程中，許多革蘭陰性細菌依靠T3S將效應蛋白輸送到真核宿主細胞。Ct在其整個發育周期中，也通過T3S實現效應蛋白的跨包涵體膜及跨宿主細胞膜運輸。有些效應蛋白，如TarP、CT694和TepP存在于Ct原體，在衣原體感染早期階段被輸送到宿主細胞，通過調節宿主機動蛋白骨架和破壞免疫信號轉導，促進衣原體侵入宿主細胞；有些效應蛋白在Ct胞內感染階段產生，而后被輸送并嵌入包涵體膜（Inc），干擾宿主細胞的細胞骨架動力學、囊泡和非囊泡運輸及死亡信號等；還有一類效應蛋白被輸送至包涵體腔或宿主細胞漿，與衣原體的能量代謝、細胞蛋白泛素化和組蛋白甲基化等密切相關［13］。已有研究證實，Ct的T3S效應蛋白IncA和Tarp為有效的疫苗候選抗原［11，14］。

大量研究證實，Th1型細胞免疫應答及IFN-γ細胞因子在抗衣原體感染過程中發揮重要作用［5-6］。2008年，KARUNAKARAN等［15］采用蛋白質組學技術，從Cm感染的DC細胞成功篩選出8個T細胞抗原，其中包含TC0420（Ct143蛋白在Cm的同源物），提示CT143免疫可能激發Th1型細胞免疫應答；2010年，WANG等［16］采用Ct全基因組編碼的抗原與99例女性生殖道Ct感染患者的血清反應，發現CT143蛋白能被50%以上的患者血清優勢識別，進一步提示CT143具有良好的免疫活性。2017年，CUNHA等［17］研究發現，CT143是Ct T3S的效應蛋白，定位于包涵體腔，但其具體功能及是否有保護作用尚未見報道。

本研究采用原核表達并純化的CT143重組蛋白，聯合Th1型細胞免疫佐劑CpG經滴鼻途徑免疫BALB/c小鼠，小鼠生殖道Cm感染模型評估CT143的對衣原體感染的保護性作用。研究發現，CT143+CpG免疫能誘導小鼠產生高滴度的特異性IgG抗體，尤其是IgG2a亞類的抗體產量顯著高于CT143免疫組及CpG佐劑對照組。有文獻報道IgG2a不僅有體外抗衣原體作用，且體液免疫應答所產生的IgG亞類中，IgG2a血清含量高于IgG1常提示機體存在Th1型細胞免疫應答［18］；CT143+CpG免疫組小鼠脾細胞體外受CT143蛋白刺激，產生的IFN-γ（Th1型）細胞因子水平顯著高于CT143不加佐劑組，而IL-5（Th2型）細胞因子水平顯著低于CT143不加佐劑組，進一步說明CT143聯合佐劑CpG免疫能誘導機體產生強烈的Th1型細胞免疫應答，該免疫應答保護小鼠快速清除下生殖道定植的衣原體。CT143免疫組小鼠感染Cm后12 d，陰道排菌量即與對照組出現統計學差異，且排菌時間明顯縮短。此外，CT143免疫還能顯著降低Cm導致的上生殖道病變，表現為輸卵管水腫減輕，炎癥細胞浸潤減少等，尤其是CT143聯合佐劑免疫組，輸卵管結構清晰，管壁皺襞且纖毛結構完整。

綜上所述，本研究采用Ct T3S效應蛋白CT143聯合佐劑CpG滴鼻免疫小鼠，成功誘導小鼠產生Th1型細胞免疫應答。該免疫應答能有效保護小鼠抵抗Cm的生殖道感染，免疫組小鼠下生殖道排菌量明顯降低，排菌周期縮短，上生殖道免疫病理減輕。本實驗結果為深入探討CT143蛋白的疫苗保護作用及衣原體聯合亞單位疫苗的研制提供了重要參考。