LncRNA AC010145.4在原發性肝細胞癌組織中的表達及對細胞增殖、侵襲的影響

郭 勇 李 波 蒲邦明 方 超 李春桃（西南醫科大學附屬中醫醫院肝膽外科，瀘州646000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大最常見的腫瘤，居全球腫瘤相關死亡原因的第三位［1］。HCC在原發性肝癌患者中占90%以上。其預后較差，5年生存率僅為17%～53%［2-3］。目前，HCC的根治性手術治療僅在疾病早期階段有效，但大多數患者在診斷時就已處于晚期，失去了手術機會。研究發現，腫瘤復發和轉移率高是導致HCC患者預后不良的主要因素。因此，迫切需要對HCC機制的新見解，以確定新的預后分子標志物和潛在的有效治療靶點，從而提高患者的存活率［4-5］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，LncRNA）是一類長度超過200個堿基對的RNA轉錄產物，表現出有限的蛋白質編碼能力。許多LncRNA在分化的組織或特定的癌癥類型中特異性表達［6-7］。近期研究發現，LncRNA通過與其他細胞大分子相互作用驅動許多重要的癌癥表型，如DNA、RNA和蛋白質［8］。也有研究發現，異常的LncRNA表達在肝癌的發生和轉移中起關鍵作用［9-10］。有研究者發現，LncRNA AC010145.4參與調節小細胞肺癌的發生和發展，然而關于LncRNA AC010145.4在原發性肝細胞癌中的表達及意義的研究卻十分有限［11］。本研究擬分析HCC癌組織中LncRNA AC010145.4的表達，并觀察其對人肝癌細胞SMMC-7721和HCCLM3細胞活力和侵襲能力的影響，以期為HCC的機制研究提供基礎資料。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2014年1月至2016年1月于我院接受手術切除術的HCC患者131例作為研究對象，收集患者相關病例資料、愈后情況。納入標準：①術后病理證實為HCC；②術前未接受抗腫瘤治療；③接受完全腫瘤切除術。排除標準：①院內死亡；②合并其他惡性腫瘤者；③病例資料不全者。本研究經我院倫理委員會批準，所有研究對象在參與本研究前均已簽署知情同意書。

1.1.2 細胞來源 HCC細胞系SMMC-7721和HCCLM3均購自于美國菌種保藏中心。SMMC-7721和HCCLM3細胞系均在5%CO2、37℃條件下培養于RPMI1640細胞培養基。

1.1.3 主要試劑與儀器RPMI1640細胞培養基購自北京友康恒業生物科技有限公司；慢病毒轉染系統由上海吉瑪生物技術有限公司設計合成；Trizol試劑盒、Prime Script RT試劑盒、SYBR premix ex TaqtmⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。Stratagene MX3005P實時熒光定量PCR儀購自美國安捷倫。

1.2 方法

1.2.1 LncRNA AC010145.4相對表達量測量 分別取50 mg癌組織和癌旁組織樣本進行超聲勻漿，Trizol試劑盒提取HCC癌組織和癌旁組中的總RNA，并逆轉錄為cDNA。按照SYBR premix ex TaqtmⅡ試劑盒說明書進行qRT-PCR實驗檢測LncRNA AC010145.4表達。PCR反應條件如下：95℃預變性10 min；（95℃15 s、60℃30 s、72℃30 s）×40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算LncRNA AC010145.4的相對表達水平。

1.2.2 慢病毒轉染LncRNA AC010145.4 siRNA SMMC-7721和HCCLM3細胞系消化和傳代時間為48 h，實驗采用對數生長相細胞。將SMMC-7721和HCCLM3細胞接種于6孔板，并培養直至達60%融合。去除6孔板中的血清，Lipofectamine 2000分別轉染經慢病毒包裝的siRNA（沉默表達組，siRNA組）和空載體（陰性對照組，Ctrl組）。繼續培養48 h后進行相關研究。

1.2.3 細胞增殖能力測定 將siRNA組和Ctrl組對數生長期的SMMC-7721和HCCLM3細胞系接種于96孔板（3 000個/孔），分別培養0 h、24 h、48 h、72 h、96 h。在添加CCK-8之前，改變培養基。每孔加入90μl培養基和10μl CCK-8。使用微孔板讀數器測定450 nm處的OD值。并繪制細胞增殖曲線。

1.2.4 細胞侵襲能力測定 取siRNA組和Ctrl組對數生長期的SMMC-7721和HCCLM3細胞進行細胞懸浮。將細胞密度調整為1×104個/ml，并將100μl細胞懸浮液添加至Transwell室。然后將800μl培養基（帶有轉染復合物或NC）加入下室的24孔板。培養24 h后，移除Transwell室，PBS沖洗后，福爾馬林固定細胞。用棉簽擦拭微孔膜上細胞，結晶紫染色。在顯微鏡下，將圖像放大200倍以計算每個區域的侵襲細胞數。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行統計分析，首先進行數據的正態分布檢測，數據均為正態分布。計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗。計數資料用頻數（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。采用受試者工作特征曲線（ROC）計算LncRNA AC010145.4對HCC患者術后生存的預測價值。采用Kaplan-Meier并Log-rank檢驗比較LncRNA AC010145.4表達對HCC患者術后總體生存時間的影響。COX回歸模型分析影響HCC患者術后生存的危險因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC癌組織中LncRNA AC010145.4表達 通過RT-qPCR檢測HCC患者的癌旁組織和癌組織中LncRNA AC010145.4的相對表達量，結果發現，與癌旁組織相比，HCC癌組織中的LncRNA AC010145.4表達顯著升高（9.13±2.43 vs 1.33±0.40），差異有統計學意義。見圖1。

圖1 HCC患者癌組織和癌旁組織中LncRNA AC010145.4的表達差異Fig.1 Different expression of LncRNA AC010145.4 in cancer and paracancerous tissuesof HCC patients

2.2 LncRNA AC010145.4表達對HCC患者的診斷價值 如圖2所示，LncRNA AC010145.4對預測HCC患者術后死亡的最佳臨界值為5.98，靈敏度為94.2%，特異度為67.7%，AUC為0.775，95%CI：0.69～0.84（P＜0.05）。

圖2 LncRNA AC010145.4預測HCC患者術后死亡的ROC曲線Fig.2 ROC curve of LncRNA AC010145.4 to predict postoperative mortality in HCC patients

2.3 LncRNA AC010145.4表達與臨床病理特征關系 根據ROC曲線結果，將LncRNA AC010145.4表達水平高于5.98者定義為高表達組（n=73），將LncRNA AC010145.4表達水平低于5.98者定義為低表達組（n=58），分析LncRNAAC010145.4相對表達量與HCC患者的臨床病理特征關系，結果如表1。LncRNA AC0 10145.4表達與患者的性別、年齡、門冬氨酸轉移酶無顯著相關性（P＞0.05），而與谷丙轉氨酶、甲胎蛋白、Child-Pugh分級、是否感染肝炎病毒、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期顯著相關（P＜0.05）。

表1 HCC患者LncRNA AC010145.4相對表達量與臨床病理特征的關系［例（%）］Tab.1 Relationship between relative expression of LncRNA AC010145.4 and clinicopathological characteristicsin HCC patients［n（%）］

2.4 HCC患者單因素生存分析結果 如圖3、表2，單因素生存分析顯示，較高甲胎蛋白水平、Child-Pugh分級B級、較大腫瘤直徑、淋巴結轉移、較高TNM分期、LncRNA AC010145.4高是經手術治療HCC患者死亡的獨立危險因素。

圖3 LncRNA AC010145.4相對表達量與HCC患者術后生存率相關性Fig.3 Correlation between relative expression of LncRNA AC010145.4 and postoperative survival rate of HCC patients

表2 HCC患者術后生存率單因素及多因素回歸分析Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression analysis for HCC patients

2.5 HCC患者Cox回歸分析結果 將單因素生存分析顯示差異有統計學意義的變量納入Cox回歸模型進行分析得出：較高甲胎蛋白水平、Child-Pugh分級B級、較大腫瘤直徑、淋巴結轉移、較高TNM分期、LncRNA AC010145.4高是經手術治療HCC患者死亡的獨立危險因素。見表2。

2.6 沉默LncRNA AC010145.4表達抑制肝細胞癌增殖 由圖4可知，siRNA組細胞增殖活力較Ctrl組明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），說明沉默LncRNA AC010145.4表達能抑制SMMC-7721和HCCLM3細胞的增殖能力。

圖4 Ctrl組與siRNA組的細胞增殖曲線比較Fig.4 Comparison of cell proliferation curve between Ctrl and siRNA group

2.7 沉默LncRNA AC010145.4表達抑制肝細胞癌侵襲 Transwell實驗表明，在×200的視野下，SMMC7721細胞siRNA組侵襲細胞數為（33±6）×103個，Ctrl組侵襲細胞數為（98±23）×103個；HCCLM3細胞siRNA組侵襲細胞數為（30±5）×103個，Ctrl組侵襲細胞數為（90±20）×103個；兩種細胞siRNA組侵襲細胞數均顯著低于Ctrl組（均P＜0.05）。結果見圖5。

圖5 沉默LncRNA AC010145.4抑制HCC侵襲（×200）Fig.5 Silence of LncRNA AC010145.4 inhibit HCC invasion（×200）

3 討論

HCC是全球范圍內癌癥相關死亡的主要原因之一，其發生發展機制十分復雜，臨床上尚未發現可靠的HCC治療靶點。研究發現，腫瘤復發和轉移是導致HCC患者預后不良的主要原因。有研究者認為，單純DNA突變并不能完全解釋HCC發生發展的復雜進程［12］。目前，基因不同水平表達調控機制研究是診斷和治療HCC的熱點。LncRNA是一類長度超過200個堿基對但不編碼蛋白質的非編碼RNA。人類基因組中LncRNA的確切數目仍存在爭議，但有研究者認為人類基因組中有超過60 000個LncRNA。最近研究發現，LncRNA是多種生物學過程中的重要分子，包括發育、表觀遺傳學、干細胞生物學、激素反應、癌癥和腦功能等。

既往研究發現，LncRNA在HCC患者的發生發展中發揮重要作用［8，13］。DING等［14］的研究發現，LncRNA PVT1在肝癌組織中表達升高，且其表達升高可增加肝癌復發的發生風險。LncRNA CCAT1在肝癌組織中高表達，且與臨床分期和腫瘤大小相關，是影響肝癌患者預后的獨立危險因子［15］。ZHANG等［16］發現，LncRNA SNHG15在肝癌組織中表達上調，且LncRNA SNHG15表達與肝癌分級、血管侵犯、TNM分期及預后相關。劉浩等［17］研究發現，LncRNA AC010145.4在直腸癌組織中相對表達量升高，可能是評估直腸癌患者預后的潛在分子標志物。然而，目前尚未發現LncRNA AC010145.4表達對HCC患者的影響。本研究發現，LncRNA AC010145.4在HCC癌組織中的相對表達量顯著高于癌旁組織，提示LncRNA AC010145.4可能在HCC中高表達。進一步研究LncRNA AC010145.4表達與HCC患者臨床病理特征的關系發現，LncRNA AC010145.4表達與HCC患者谷丙轉氨酶、甲胎蛋白、Child-Pugh分級、是否感染肝炎病毒、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期有關，與既往研究結果類似。

既往研究發現LncRNA CCAT1是影響肝癌患者預后的獨立危險因子［15］。劉浩等［17］報道，LncRNA AC010145.4是評估直腸癌患者預后的潛在分子標志物。趙沖等［11］發現，LncRNA AC010145.4高表達小細胞肺癌患者的總體生存時間和無進展生存時間均短于低表達者。本研究以ROC曲線得出臨界值，證實LncRNA AC010145.4低表達組總體生存率顯著高于LncRNA AC010145.4高表達組。提示LncRNA AC010145.4可能與疾病進展有關，是HCC患者預后的影響因素之一。

細胞惡性增殖、侵襲及遷移是腫瘤發展過程中的主要特征之一［18-19］。HUANG等［18］研究發現，LncRNA CDKN2B-AS1可通過靶向let-7c-5p/NAP1L1軸促進肝癌細胞的增殖和侵襲。YAN等［20］發現LncRNAmiR31HG可通過靶向miR-575抑制肝癌細胞的增殖和侵襲。本研究通過CCK-8和Transwell實驗發現，SMMC-7721和HCCLM3細胞系上LncRNA AC010145.4沉默表達組OD450nm值顯著低于Ctrl組，且侵襲細胞數顯著少于Ctrl組，這與HCC癌組織內的結果一致，提示LncRNA AC010145.4沉默表達可能具有抑癌作用。進一步證實了LncRNA AC010145.4可能與HCC病理生理機制相關。

綜上所述，本研究首次報道了LncRNA AC010145.4在HCC癌組織中表達升高，且與不良臨床病理特征相關。體外試驗發現，沉默LncRNA AC010145.4表達可抑制HCC細胞系增殖和侵襲，提示LncRNA AC010145.4在HCC中可能起到促癌基因的作用。然而，影響HCC發生發展的分子機制復雜，LncRNA AC010145.4調節HCC患者發生發展的具體作用機制及參與的信號通路尚需進一步研究。