IL-33在結(jié)腸癌患者中的表達水平及臨床研究

王紅敏 郭 瑛（北京市垂楊柳醫(yī)院，北京100022）

結(jié)腸癌是一種臨床常見消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，隨著近些年人們生活水平的逐漸提高以及人類飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)生率、死亡率均明顯升高，在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中，結(jié)腸癌的發(fā)病率已躍居第三位，且該病的5年生存率僅為50%［1-2］。目前，對于結(jié)腸癌的治療，臨床主要有手術(shù)、化療、放療及分子靶向治療等方式，隨著腫瘤及免疫學(xué)研究進展，有望發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌新的治療措施［3］。IL-33是近年發(fā)現(xiàn)的IL-1家族的一種新成員，由于其最早發(fā)現(xiàn)于小靜脈高壁內(nèi)皮細胞，所以又稱為“高壁內(nèi)皮細胞來源的核因子”［4］。有研究證實在多種慢性炎癥發(fā)病過程中，IL-33表達明顯增強，在多種惡性腫瘤（如卵巢癌、肺癌、乳腺癌及結(jié)腸癌等）的發(fā)病過程中，IL-33也高度表達，在腫瘤的臨床診斷及評估預(yù)后中也是重要標志物，同時還有研究人員發(fā)現(xiàn)IL-33在抗腫瘤反應(yīng)中起誘導(dǎo)作用，可稱為新的抗腫瘤抑制劑［5-7］。可見，IL-33是一種雙功能蛋白，既是一種誘發(fā)炎癥反應(yīng)的細胞因子，又是可調(diào)控轉(zhuǎn)錄的細胞核因子［8］。本次研究的目的在于探討結(jié)腸癌患者其外周血內(nèi)IL-33水平及其相關(guān)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料 納入2016年1月至2017年12月我院收入治療的結(jié)腸癌患者進行研究。納入標準：患者經(jīng)臨床病理診斷后確診是結(jié)腸惡性腫瘤，病理類型均為結(jié)腸腺癌；患者既往無神經(jīng)系統(tǒng)疾病、嚴重的器質(zhì)性疾病及心理精神等疾病。排除標準：結(jié)腸惡性腫瘤的病理類型屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或其他類型，不屬于結(jié)腸腺癌的患者；出現(xiàn)嚴重的肝腎功能損傷或機體內(nèi)環(huán)境紊亂者；近期曾服用精神類藥品或?qū)λ幬镉羞^度依賴者；研究過程中自動退出者。根據(jù)上述標準，共納入110例結(jié)腸腺癌患者作為觀察組，同時選擇同期來我院健康體檢的100名成年人作為對照組。本研究已通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審議，患者及其家屬簽署本次研究知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 收集兩組成員基本臨床資料（性別、年齡等），觀察組按照Ducks癌癥分期標準，A～B期63例，C～D期47例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟及美國癌癥聯(lián)合委員會制定的癌癥TNM分期標準，Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期58例；有淋巴轉(zhuǎn)移者49例，無淋巴轉(zhuǎn)移者61例。根據(jù)觀察組結(jié)腸腺癌的分化程度進行分級，若腺上皮細胞呈管狀/乳頭狀排列，且未見明顯的異性細胞，核分裂較少，為高分化（29例），若腫瘤細胞的排列呈實質(zhì)狀/片狀，僅見灶性的腺樣組織結(jié)構(gòu)，見明顯的異性細胞、核分裂較多且有壞死，為低分化（37例），介于以上兩種分化程度的為中分化（44例）。觀察組分為3個亞組，即高分化組29例、中分化組44例、低分化組37例。

1.2.2 ELISA和免疫組化實驗檢測IL-33水平及IL-33、IFN-γ、IL-4表達的數(shù)目 抽取觀察組與對照組的空腹靜脈血各5 ml，采用ELISA檢測外周血中IL-33水平。觀察組接受手術(shù)切除治療，術(shù)中切取腫瘤病理組織，制作切片并分別進行免疫組化染色，染色后進行封片，在顯微鏡下觀察，以500個細胞為1個計數(shù)單位，記錄其中IL-33、IFN-γ、IL-4呈陽性表達的數(shù)目。在結(jié)腸癌的腫瘤組織內(nèi)，上述幾種細胞因子呈陽性的細胞主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達，呈現(xiàn)淺黃色或者棕黃色。具體計分標準：細胞未染色者為0分，細胞呈較少的淡黃色為1分，細胞呈較多的棕黃色為2分，細胞呈大量的深棕色為3分。在顯微鏡下觀察時，每500個細胞視野內(nèi)，染色細胞數(shù)＜30%者記1分，30%≤染色細胞數(shù)＜76%者記2分，染色細胞數(shù)≥76%者記3分。以上兩項得分相乘，0分者為“-”，1～4分者為“+”，大于4分者為“++”，“-”為IL-33陰性，“+”及“++”為IL-33陽性。

1.2.3 觀察組患者術(shù)后隨訪 對觀察組患者術(shù)后進行為期2年的隨訪，統(tǒng)計觀察組患者不同TNM分期術(shù)后2年的死亡率，對影響結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的因素進行Logistic回歸分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本項研究中的相關(guān)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理及分析。經(jīng)檢測，本研究中所有計量資料均符合正態(tài)分布，計量資料以±s的形式表示，比較時使用t檢驗法；計數(shù)資料進行比較采用χ2，多因素回歸分析使用Logistic法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較兩組患者的臨床相關(guān)資料及血清IL-33水平 兩組患者性別、年齡均差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），觀察組血清IL-33水平為（44.23±11.31）pg/ml，明顯高于對照組（28.35±7.86）pg/ml，P=0.000，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 兩組患者的臨床相關(guān)資料及血清IL-33水平（±s）Tab.1 Clinical data and serum IL-33 level were compared between two groups（±s）

表1 兩組患者的臨床相關(guān)資料及血清IL-33水平（±s）Tab.1 Clinical data and serum IL-33 level were compared between two groups（±s）

Groups Observation Control t/χ2 P n 110 100 Gender（male/female）56/54 52/58 0.291 0.590 Age（year）57.28±6.55 58.71±6.39 1.590 0.111 IL-33（pg/ml）44.23±11.31 28.35±7.86 11.703 0.000

2.2 比較觀察組血清IL-33水平與結(jié)腸腺癌臨床病理特征相關(guān)性 觀察組血清IL-33水平與患者的年齡、性別無關(guān)，與腫瘤病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，T3～4期的IL-33水平明顯高于T1～2期（P＜0.05），TNMⅢ～Ⅳ期的IL-33水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的IL-33水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05），見表2。

表2 觀察組血清IL-33水平與結(jié)腸腺癌臨床病理特征相關(guān)性（±s）Tab.2 Correlation between serum IL-33 level and clinicopathological characteristics of colon adenocarcinoma in observation group（±s）

表2 觀察組血清IL-33水平與結(jié)腸腺癌臨床病理特征相關(guān)性（±s）Tab.2 Correlation between serum IL-33 level and clinicopathological characteristics of colon adenocarcinoma in observation group（±s）

Clinicopathological characteristics Age（year）＜60≥60 Gender Male Female Tstage T1～2 T3～4 TNMstageⅠ～ⅡⅢ～ⅣLymph node metastasis Yes No n 48 62 56 54 59 51 52 58 49 61 IL-33（pg/ml）45.48±9.16 42.34±8.24 48.32±8.71 46.05±8.63 38.18±7.62 45.35±8.44 40.31±9.17 46.47±8.62 45.88±5.92 43.19±6.27 t 1.888 1.373 4.682 3.631 2.307 P 0.062 0.173 0.000 0.000 0.023

2.3 免疫組化檢測觀察組不同病理特征患者IL-33表達水平 免疫組化法檢測觀察組腫瘤組織IL-33陽性表達細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度較低、臨床分期較高的患者腫瘤組織中IL-33陽性表達數(shù)目較高，見表3。

表3 免疫組化檢測觀察組不同病理特征患者IL-33表達水平（±s）Tab.3 Expression levels of IL-33 in patients with different pathological characteristics were detected by immunohistochemistry（±s）

表3 免疫組化檢測觀察組不同病理特征患者IL-33表達水平（±s）Tab.3 Expression levels of IL-33 in patients with different pathological characteristics were detected by immunohistochemistry（±s）

Note：Compared with high differentiated tumors，1）P＜0.05；compared with low differentiated tumors，2）P＜0.05.

Pathological characteristics Degreeof tumor differentiation Low differentiation Moderatedifferentiation High differentiation Tstage T1～2 T3～4 Nstage N0 N1～2 TNMstageⅠ～ⅡⅢ～Ⅳn 37 44 29 59 51 67 43 52 58 IL-33 positive cell number 4.94±2.31 3.19±2.11 2.15±1.39 2.45±1.62 4.17±2.37 2.11±1.70 3.99±.23 2.47±1.72 4.27±2.14 t 5.736 2.338 4.492 5.002 4.731 P 0.0002）0.0001）0.000 0.000 0.000

2.4 免疫組化檢測觀察組3個亞組IL-33、IL-4、IFN-γ表達水平比較 觀察組3個亞組中IL-33、IL-4表達水平為低分化組＞中分化組＞高分化組（P＜0.05），IFN-γ表達水平無明顯差異（P＞0.05），見表4。

表4 免疫組化檢測觀察組3個亞組IL-33、IL-4、IFN-γ表達水平比較（±s）Tab.4 Comparison of expression levels of IL-33，IL-4 and IFN-γin three subgroups of observation group by immunohistochemistry（±s）

表4 免疫組化檢測觀察組3個亞組IL-33、IL-4、IFN-γ表達水平比較（±s）Tab.4 Comparison of expression levels of IL-33，IL-4 and IFN-γin three subgroups of observation group by immunohistochemistry（±s）

Note：Compared with high differentiated tumors，1）P＜0.05；compared with low differentiated tumors，2）P＜0.05.

Groups Low differentiation Moderate differentiation High differentiation n 37 44 29 IL-33 positive cell number 4.94±2.311）3.19±2.112）2.15±1.39 IL-4 positive cell number 10.84±2.02 1）8.36±1.80 2）6.02±1.05 IFN-γpositive cell number 24.81±5.43 24.66±4.80 25.40±5.61

2.5 術(shù)后2年隨訪并統(tǒng)計觀察組患者死亡率 術(shù)后2年隨訪發(fā)現(xiàn)，觀察組腫瘤組織病理分期越高的死亡率越高，見表5。

表5 術(shù)后2年隨訪并統(tǒng)計觀察組結(jié)腸腺癌患者死亡率［例（%）］Tab.5 Mortality rate of patientswith colorectal adenocarcinoma in observation group was statistically analyzed after 2 years of follow-up［n（%）］

2.6 影響結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的多因素回歸分析Logistic多因素回歸分析，IL-33水平是影響結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素，見表6。

表6 影響結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的多因素回歸分析Tab.6 Multivariate regression analysisof prognosis in patients with colon adenocarcinoma

3 討論

IL-1家族新成員IL-33在巨噬細胞、上皮細胞、肥大細胞及內(nèi)皮細胞等多種細胞中均可表達，當(dāng)機體細胞受損時會有大量IL-33生成，IL-33亦稱“警戒素”，在多種慢性炎癥，如關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、哮喘等發(fā)病過程中大量表達［9］。由于細胞類型的差別，IL-33可誘發(fā)多種炎癥反應(yīng)，如IL-33誘導(dǎo)機體肥大細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6等多種細胞因子，誘導(dǎo)Th2淋巴細胞生成IL-5和IL-13等細胞因子［10-11］。大量研究證實，機體慢性炎癥與腫瘤的發(fā)病具有相關(guān)性，在腫瘤發(fā)生的炎癥微環(huán)境中，IL-33是主要成分并可進一步誘發(fā)腫瘤［12-13］。有研究人員在乳腺癌動物模型中發(fā)現(xiàn)IL-33誘導(dǎo)IL-10、IL-13及調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的生成，加重腫瘤的發(fā)展浸潤［14］；在胃癌動物模型中，IL-33增加IL-6及金屬蛋白酶（MMP-3）的分泌，誘發(fā)癌細胞浸潤轉(zhuǎn)移［15］。

本研究對比結(jié)腸癌患者與健康人血清中IL-33水平，發(fā)現(xiàn)IL-33在結(jié)腸癌患者中表達明顯升高；血清IL-33水平在不同年齡、不同性別的結(jié)腸癌患者之間無顯著差異；根據(jù)結(jié)腸癌患者腫瘤分化程度及TNM分期不同，進一步比較亞組患者血清中IL-33水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度較低、臨床病理分期較高的患者血清IL-33明顯升高。免疫組化法對觀察組結(jié)腸癌患者的腫瘤組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著結(jié)腸癌患者腫瘤組織的分化程度降低、臨床病理分期較高的患者腫瘤組織中IL-33陽性表達數(shù)目較高。術(shù)后2年隨訪發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織病理分期較高的死亡率隨之增高。

惡性腫瘤的發(fā)生與機體免疫系統(tǒng)Th1/Th2細胞失衡有關(guān)，腫瘤細胞的分化可抑制Th1型細胞因子的分泌、促進Th2型細胞因子的生成，導(dǎo)致免疫逃逸及Th1/Th2失衡［16］。關(guān)于IL-33在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)IL-33是促進Th2型細胞因子生成的誘導(dǎo)劑，IL-33可抑制鈣黏蛋白在腫瘤細胞間的表達，并對腫瘤血管內(nèi)皮細胞分化、增殖具有較強的刺激作用，促進血管的形成［17-18］。ST2是一種在Th2細胞中大量表達的IL-33受體，有研究發(fā)現(xiàn)IL-33由IL-33/ST2L信號通路誘導(dǎo)惡性腫瘤的發(fā)生，同時激活自然殺傷性細胞相關(guān)通路、促進Th2型細胞因子的表達［19-20］。Th1型細胞因子主要有IFNγ、IL-12，Th2型細胞因子主要有IL-4、IL-10等。為進一步研究和探討IL-33引發(fā)結(jié)腸癌的免疫學(xué)機制，本研究發(fā)現(xiàn)，IL-33、IL-4表達水平隨觀察組患者分化程度的不同而有明顯差異，IL-33、IL-4表達水平為低分化組＞中分化組＞高分化組。可見，分化程度越低的結(jié)腸癌患者，IL-33、IL-4表達水平越高，IL-33促進Th2型細胞因子的分泌及Th1/Th2失衡，與前人研究一致。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌患者外周血中IL-33水平明顯升高，IL-33與結(jié)腸癌病情程度呈正相關(guān)，IL-33的檢測對結(jié)腸癌的診斷具有積極意義，但是，近年隨著對IL-33研究的深入，發(fā)現(xiàn)IL-33能誘導(dǎo)機體CD8+T細胞分泌IFN-γ，提高機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，對腫瘤的監(jiān)測及抑制具有積極作用，有學(xué)者在肺癌動物模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IL-33的表達能抑制腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移［19-20］。關(guān)于IL-33在腫瘤中作用的相關(guān)研究目前尚未有定論，在不同的腫瘤組織中，IL-33發(fā)揮的作用不同，仍有待進一步的研究。