HLA-A2限制性CDKN1A編碼突變肽的預測及其在膀胱癌中的應答性分析

王 晨 劉源涌 夏維敏 季 萍 余奇文 曹志偉 王 穎 沈海波

（上海交通大學醫學院附屬新華醫院泌尿外科，上海200082）

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，也是全身十大常見腫瘤之一。2020年美國最新統計數據顯示，膀胱腫瘤約有81 400例新發病例，17 980例死亡病例［1］，中國2015年的癌癥統計數據顯示，膀胱腫瘤約有80 500例新發病例，32 900例死亡病例［2］。膀胱癌可以發生在任何年齡，且有兒童發病的報道，隨年齡增長，其發病率也在增加，高發年齡為60歲左右，男性膀胱癌發病率高于女性。2016年美國的一項調查數據顯示，35%的膀胱癌患者被診斷為侵襲性膀胱癌，5年生存率為70%，其中肌層浸潤型膀胱癌預后更差，5年生存率約為47%［3］。因此，提高膀胱癌的臨床診斷和治療手段仍然是泌尿外科面臨的重大挑戰。

二代測序技術產生的腫瘤基因組數據為研究腫瘤的進化提供了越來越多的實證，其中通過分析腫瘤局部和正常組織（或是外周血）的全外顯子測序則為研究體細胞突變特征提供了直接的證據，由此產生的腫瘤新抗原譜的概念也在新技術的背景下應運而生［4］。相較于經典的腫瘤相關抗原或是腫瘤特異性抗原的概念更加關注于完整抗原分子在腫瘤和正常組織中表達格局的差異，腫瘤新抗原則根據腫瘤產生過程中的突變累積理論，突出了在腫瘤發生發展過程中所出現的各種體細胞突變所產生的新抗原表位，通過二代測序技術和高通量生物信息學手段，獲得更加全面的由單核苷酸突變或是框移突變或是缺失導致的腫瘤細胞的突變譜，由此所獲得的抗原新表位既有腫瘤共性，也存在個性化［5-6］。這些突變的腫瘤新抗原一旦被提呈到細胞膜表面，就有可能被特異性的T細胞識別，成為抗腫瘤免疫應答的最有功效的細胞［7］。近年來，在各類腫瘤中開展了腫瘤新抗原的篩選，并在實驗動物的抗腫瘤研究中獲得良好結果，在小規模人群樣本中也得到驗證［8-9］。如在小鼠腫瘤模型中（肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等），腫瘤新抗原疫苗能夠引起足夠的T細胞反應，控制腫瘤細胞生長，為腫瘤新抗原療法的臨床應用提供了理論支撐［10］。在人類，基于腫瘤新抗原的腫瘤疫苗在黑色素瘤患者中顯示出一定的臨床抗腫瘤成效，即使未得到控制的患者，在聯合免疫檢查點抑制劑治療后，也達到臨床治愈的標準［11-12］。因此，基于腫瘤新抗原的免疫治療顯示出了良好的臨床應用前景。

本研究利用TCGA數據庫中膀胱癌全外顯子數據，通過生物信息學方法篩選獲得一個具有高表達量的基因CDKN1A存在HLA-A2限制性的突變位點，對該基因編碼的野生型和突變型肽段親和力進行檢測，另外在中國膀胱癌人群中驗證了肽段特異性T細胞免疫反應性［7］。

1 材料與方法

1.1 材料 T2細胞購自美國ATCC細胞庫，并在實驗室常規保存；IMDM完全培養基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素（PS）和磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Gibco公司；β2微球蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；抗原肽由上海生工公司合成；96孔U底板購自美國BD公司；PE-抗HLA-A2分子的抗體（克隆號BB7.2）購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 患者信息 本研究招募了140例于2017年9月至2019年6月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院泌尿外科接受手術治療的膀胱癌患者。術前采集全血20 ml，置于抗凝管中，用于進一步實驗。納入標準如下：①未使用免疫抑制劑；②病理證實的尿路上皮癌；③術前全血檢測為HLA-A2陽性。排除標準如下：①術前接受化療/放療的患者；②有血液病或自身免疫病；③缺乏臨床資料或實驗室檢測資料。本研究共排除100例患者，其中HLA-A2陰性82例，4例為血液病或自身免疫病患者，6例患者缺乏臨床資料，8例患者的實驗室數據不完整。最后，共有40例患者被納入本研究，其臨床病理特征見表1。此項研究通過上海交通大學醫學院附屬新華醫院倫理委員會的倫理論證，且所有參與研究的患者都已知情，并簽署知情同意書，研究程序遵循赫爾辛基宣言。

表1 40例HLA-A2陽性患者臨床特征的統計學描述［±s，例（%）］Tab.1 Statistical description of clinical characteristics of 40 HLA-A2（+）patients［±s，n（%）］

表1 40例HLA-A2陽性患者臨床特征的統計學描述［±s，例（%）］Tab.1 Statistical description of clinical characteristics of 40 HLA-A2（+）patients［±s，n（%）］

Characteristics Mean age±SD（year）Gender Male Female Pathology Pathologic tumor stage Ta，T1 T2 T3 T4 Pathologic nodal stage N0 Histology Urothelial carcinoma Cohort（n=40）68±13 33（82.5）7（17.5）32（80）4（10）3（7.5）1（2.5）40（100）40（100）

1.2.2 生物信息學篩選 412例膀胱癌全外顯子測序的突變數據來源于TCGA數據庫（https：//gdac.broadinstitute.org/），轉錄蛋白序列信息來源于美國國家生物信息學中心（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。對于存在突變序列的基因，根據轉錄組數據獲得蛋白質序列，利用一個9肽的滑窗產生覆蓋突變氨基酸位點的突變肽段序列，相對應的野生型肽段序列來自配對外周血的全外顯子數據。最后，利用NetMHCpan-3.0算法在線計算所有野生型及突變型肽段與HLA-A*02：01分子的結合力（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan-

3.0/）。按照結合力不同分成3類，其中結合力＜50為強結合，50～500為弱結合，＞500為無結合，選取突變型肽段強結合而對應野生型肽段無結合的配對抗原肽，送合成。

1.2.3 體外親和力測定 T2細胞復蘇之后，在IMDM完全培養基（IMDM培養基+10%FBS和1%PS）中培養至第七代，將細胞懸液轉移到50 ml離心管中，細胞計數，調整細胞濃度0.5×106個/ml。在37℃細胞培養箱中，T2細胞（0.5×106個/ml）、β2微球蛋白和候選肽段在96孔U底板（美國BD公司）的200μl體系中共孵育4 h。L235肽段為陽性對照［13］，不加入肽段只包含T2細胞的IMDM完全培養基為陰性對照。

孵育結束后，使用流式細胞儀檢測T2細胞表面的HLA-A2分子表達量。T2細胞用PBS離心（2 000 r/min離心5 min）洗滌后，將T2細胞和PE-抗HLA-A2分子的抗體在4℃避光孵育40 min，孵育結束后再用PBS洗滌2次，洗去殘留的抗體后使用200μl PBS重懸，轉入流式管，使用FACSCantoⅡ流式儀收集細胞；采用FlowJo軟件（TreeStar公司）進行分析，以平均熒光強度（MFI）來代表肽段刺激引起的T2細胞表面HLA-A2分子的表達量。

為了確認候選肽段的親和力常數，我們將T2細胞、β2微球蛋白和不同濃度（0、0.4、2、10、20μg/ml）的HLA-A2限制性抗原肽共同孵育4 h后，經PE-抗HLA-A2抗體標記T2細胞后，由FACSCantoⅡ流式儀收集T2細胞并檢測細胞表面HLA-A2分子的表達，選擇以呈現50%的最強MFI的候選肽段濃度（即Kd值）來表示HLA-A2限制性候選肽段的親和力。擬合曲線的Kd值由Graphpad Prism 6.0軟件（Graphpad software Inc.，CA，USA）計算得出，用于代表抗原肽的親和力水平。

1.2.4 酶聯免疫斑點試驗 使用密度梯度離心法從新鮮采集的膀胱癌患者20 ml全血中分離外周血單 個 核 細 胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，用肽段（2μg/ml）在37℃下刺激PBMCs（0.25×106個/孔）20 h。孵育結束后收集細胞，按照說明書（human IFN-γELISpot kit，U-CyTech，Utrecht，Netherlands）檢測抗原肽特異性IFN-γ分泌量。板晾干后用ELISpot計 數 儀（BioReader Model 4000；Bio-Sys GmbH，Karben，Germany）對斑點進行計數。以單個肽段每2.5×105個細胞的斑點形成單位（spot forming units，SFUs）減空白對照的斑點形成單位計算抗原肽特異性IFN-γ分泌細胞數。

1.3 統計學分析 使用SPSS21軟件（IBM SPSS Software，USA）對數據進行統計分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CDKN1A突變抗原肽的預測 根據TCGA數據庫分析，CDKN1A基因在膀胱癌中的表達量為115.12，位于較高方位。利用TCGA數據中412例膀胱癌和配對外周血，結合美國國家生物信息學中心的序列檢索和突變位點與HLA-A*0201的親和力預測，我們篩選獲得了一個在膀胱癌中高表達的基因CDKN1A，其在腫瘤全外顯子測序結果中發現272位含有1個錯義突變，所產生的突變肽段FVTETPLEV和外周血中的野生型抗原肽相比，第61位的氨基酸殘基從G變為V，使其與HLA-A*0201的預測親和力提高了600倍（表2）。

表2 CDKN1A基因編碼的HLA-A*02：01限制性預測肽段的信息Tab.2 Information of CDKN1A coded HLA-A*02：01 restricted prediction peptides

2.2 CDKN1A突變抗原肽的親和力測定 將上述兩個抗原肽合成后，我們進一步采用T2細胞進行親和力的體外測定，將兩個抗原肽分別和T2細胞共培養4 h后，與CDKN1A突變肽段孵育的T2細胞表面HLA-A2分子的MFI顯著高于野生型抗原肽段的MFI，顯示突變肽段與HLA-A2分子的親和力要顯著高于野生型肽段，與生物信息學預測結果一致（圖1）。當將不同濃度的突變型和野生型抗原肽分別與T2細胞共孵育之后，突變型抗原肽隨著孵育濃度的增加，其MFI的值也隨之升高，而野生型抗原肽的MFI并未隨濃度變化而增大。對不同濃度的突變型肽段MFI進行曲線擬合和計算后，CDKN1A突變型抗原肽的Kd值為3.724 mg/ml（圖2）。

圖1 CDKN1A突變型和野生型抗原肽與HLA-A2的結合力測定Fig.1 Detection of affinity between CDKN1A coded peptides and HLA-A2 molecule

圖2 基于T2細胞體外實驗的抗原肽親和力常數測定Fig.2 Determination of affinity constant of peptide based on T2 cell experiment in vitro

2.3 CDKN1A突變型和野生型抗原肽在膀胱癌患者中的免疫反應性評價 我們在40例HLA-A2陽性膀胱癌患者中進行外周突變型和野生型抗原肽特異性免疫反應測定，將外周PBMCs分別用野生型和突變型抗原肽刺激后，酶聯免疫斑點實驗檢測CDKN1A野生型和突變型抗原肽特異性分泌IFNγ的細胞數（SFUs）（圖3）。結果顯示，在40例膀胱癌患者中，具有突變型抗原肽特異性的陽性反應率（SFUs＞5）為25%（10/40），而野生型抗原肽特異性的陽性率為7.5%（3/40），兩組反應率之間有顯著性差異（P=0.034）。

圖3 CDKN1A基因編碼突變型和野生型抗原肽在40例HLA-A2（+）膀胱癌患者外周血單個核細胞中的特異性免疫反應檢測Fig.3 Immunoreactivity of CDKN1A coded WT and MT peptides which detected in 40 HLA-A2（+）bladder cancer patients peripheral blood mononuclear cells

進一步比較40例患者中陽性反應性的突變型和野生型抗原肽特異性的平均SFUs，結果如圖4所示突變型抗原肽特異性的SFUs為4.16，野生型抗原肽特異性的SFUs為2.44，兩者之間差異具有統計學意義（P=0.045）。上述結果表明，CDKN1A突變型抗原肽在膀胱癌患者外周的免疫反應性要高于野生型抗原肽。

圖4 CDKN1A突變型和野生型抗原肽的應答水平比較Fig.4 Comparison of CDKN1A coded MT and WT peptide response

3 討論

本研究利用TCGA公共數據庫中的WES數據篩選獲得了在膀胱癌中高表達的CDKN1A基因編碼的HLA-A2限制性的突變型抗原肽，該肽段和野生型肽段相比，具有和HLA-A2分子更高的結合力，并在膀胱癌患者外周表現出較高和較為廣泛的免疫反應性，為將該突變抗原肽應用于臨床提供了理論基礎。

CDKN1A基因全稱為細胞周期依賴性激酶抑制劑-1A，該基因編碼的蛋白屬于強效的細胞周期依賴性激酶抑制劑，又稱為p21蛋白，p21蛋白可與細胞周期依賴性激酶CDK2或者CDK4復合物結合并抑制其活性，在G1期發揮調節細胞周期的作用［14］。該基因的表達受抑癌蛋白p53的嚴格控制，通過p53介導的細胞周期G1期阻滯，以應對各種應激刺激［15］。CDKN1A基因是膀胱癌腫瘤抑制基因，該基因突變與膀胱癌發生發展密切相關［16］。伴隨著CDKN1A基因在腫瘤細胞中的突變，不僅會影響其生物學功能，同時所產生的突變型位點導致的突變抗原肽也可能成為腫瘤新抗原，被T細胞識別，導致T細胞的激活和特異性殺傷腫瘤細胞。本研究通過生物信息學的方法，獲得了在膀胱癌中多個CDKN1A基因的突變位點，其中預測能夠與HLA-A2結合的抗原肽僅此一對，分析該突變位點，可以發現雖然位于編碼區，但是并不影響蛋白功能。而由此產生的HLA-A2限制性的突變抗原肽成為具有應用潛力的腫瘤新抗原的候選抗原肽，不僅具有比野生型抗原肽更高的與HLA-A2的結合力（親和力），同時在膀胱癌患者中具有較廣的免疫反應性和免疫應答水平。

另外我們也注意到，WT抗原肽在膀胱癌患者的PBMC中也刺激產生了少量的免疫應答。最近發表的一項關于從健康人體內獲取腫瘤新抗原特異性T細胞的研究，表明腫瘤新抗原對應的野生型肽段也能夠誘導與突變型肽段反應類似的抗原特異性T細胞［17］，這表明野生型肽段本身也具有一定程度的免疫原性，能夠部分支持我們在膀胱癌患者中檢測到WT特異性T細胞反應的結果。

一項針對TCGA數據庫中的膀胱癌分子特征的研究，顯示膀胱癌中的高突變負荷主要來源于載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide，APOBEC）家族介導的基因突變，具有APOBEC相關突變特征的膀胱癌患者的5年生存率達到了75%，高突變負荷帶來的大量腫瘤新抗原也為膀胱癌患者的生存提供了獲益［18］。另一項針對腫瘤新抗原反應性的腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）的研究，表明膀胱癌中存在腫瘤新抗原反應性TILs，這可能有助于解釋免疫檢查點抑制劑在膀胱癌中有效的原因，也為未來靶向新抗原的過繼性T細胞治療提供了理論依據［19］。

在此項研究中篩選獲得的腫瘤新抗原，可以作為治療性疫苗開展臨床應用，如黑色素瘤、胰腺癌等，有臨床研究在黑色素瘤中篩選得到潛在的腫瘤新抗原，制備成為疫苗后，回輸到患者體內，大多數患者的黑色素瘤得到控制，未得到控制的患者經過免疫檢查點抑制劑治療后，也達到臨床治愈的標準［11］。更重要的是隨著免疫檢查點抑制劑在包括膀胱癌在內的多種腫瘤中的臨床治療的成功［20］，將所篩選獲得腫瘤新抗原聯合免疫檢查點抑制劑的應用也正成為腫瘤免疫治療聯合應用的策略之一，如卵巢癌、黑色素瘤等，研究發現接受腫瘤新抗原和免疫檢查點抑制劑組合治療的卵巢癌患者表現出了較好的臨床獲益，同時在卵巢癌小鼠模型中，聯合使用腫瘤新抗原疫苗明顯提高了免疫檢查點抑制劑的治療效果［21］。

在此項研究中，我們只挑選了CDKN1A基因編碼的HLA-A*02：01限制性肽段進行了合成，還有其他HLA亞型限制的肽段未納入我們的研究范圍。另有研究表明，MHC-Ⅱ類分子限制的肽段（主要引起CD4+T細胞的抗腫瘤免疫應答）也有可能成為腫瘤新抗原，但是MHC-Ⅱ類分子的結構更加復雜，表位長度更長，變量更多，并且需要更多的數據來支撐模型，所以預測算法尚未完善。

我們所篩選獲得的CDKN1A基因編碼突變抗原肽可以直接用于治療性疫苗的臨床研究，通過對患者組織樣本中CDKN1A基因突變的篩查，進行個性化的疫苗使用或是和免疫檢查點抑制劑聯合使用，從而為膀胱癌的臨床治療提供更有針對性的方案。