PI3K 抑制劑聯(lián)合地塞米松改善氧化應(yīng)激細(xì)胞模型對(duì)激素的敏感性及其分子機(jī)制①

曾瑜真 杜開(kāi)鋒 金建軍 閔智慧 毛若琳 陳智鴻

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，上海200032）

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GC）是治療哮喘、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）等慢性氣道炎癥最常用的藥物，尤其在控制輕中度哮喘中效果最佳，然而重癥哮喘、吸煙哮喘患者以及部分COPD 患者對(duì)激素治療效果卻不理想［1-2］。盡管重癥哮喘占比較少，但其對(duì)GC 敏感性降低，由此導(dǎo)致的病死率較高，據(jù)報(bào)道每年因哮喘死亡的人數(shù)高達(dá) 25 萬(wàn)［3-4］。在 COPD 管理中，越來(lái)越多的研究提示目前推薦的高劑量ICS 獲益不足［5］。因此，針對(duì)慢性氣道炎癥疾病開(kāi)發(fā)更為有效的治療方案，對(duì)于減輕患者和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)尤為重要。

氧化應(yīng)激是哮喘、COPD 等慢性氣道炎癥的主要發(fā)病機(jī)制之一，它可使組蛋白去乙酰化酶（his?tone deacetylase，HDAC）-2 活力降低、轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)和促炎信號(hào)通路增加等，這些可能導(dǎo)致激素不敏感［5-6］。氧化應(yīng)激同時(shí)激活 PI3Kδ/Akt 信號(hào)通路，PI3Kδ 作為潛在的抗炎靶點(diǎn)可引起中性粒細(xì)胞活化，與哮喘和COPD對(duì)激素不敏感密切相關(guān)［7-8］。IL-8在中性粒細(xì)胞趨化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，是COPD、哮喘等慢性氣道炎癥的促炎標(biāo)志物，同時(shí)也可能是預(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度的標(biāo)志［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)COPD 患者支氣管上皮IL-8 表達(dá)的基線水平較高，可誘導(dǎo)黏蛋白基因表達(dá)導(dǎo)致氣道黏液高分泌［11］。重癥哮喘患者誘導(dǎo)痰上清中IL-8 濃度高于輕度哮喘患者，預(yù)示其炎癥控制較差，預(yù)后不佳［3］。

本研究通過(guò)H2O2刺激人巨噬細(xì)胞系U937 細(xì)胞建立H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞模型，模擬重癥哮喘、吸煙哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的氧化應(yīng)激-激素耐受效應(yīng)。基于 IL-8 需在 TNF-α、LPS 等誘導(dǎo)劑作用下合成釋放，本研究選取TNF-α 作為炎癥誘導(dǎo)劑，單用PI3K抑制劑或PI3K抑制劑聯(lián)合Dex干預(yù)細(xì)胞模型，探討PI3K通路在慢性氣道炎癥中的作用機(jī)制，為臨床治療慢性氣道炎癥開(kāi)辟新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人巨噬細(xì)胞系U937由中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

1.1.2 主要試劑 Dex、TNF-α、H2O2購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PI3K 抑制劑 BZE235、LY294002 購(gòu)自 Selleck公司；IL-8 ELISA 試劑盒購(gòu)自 R&D 公司；NF-κB、Jun、FOS 磷酸化抗體購(gòu)自 CST 公司；TRIzol 購(gòu)自Invitrogen 公司；熒光定量PCR 試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 TaKaRa 公司；HDAC2 Assay Kit 購(gòu)自 Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組方案 ①H2O2-TNFα-U937細(xì)胞模型建立：U937 細(xì)胞分為未處理組與H2O2（400 μmol/L）刺激組，培養(yǎng) 4 h 后，分別加入0.1 μmol/L Dex 作用 45 min，各孔給予 20 ng/ml TNF-α 培養(yǎng)24 h，取上清，按照說(shuō)明書采用ELISA 檢測(cè)IL-8 的表達(dá)。各組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。②運(yùn)用H2O2-TNFα-U937細(xì)胞模型篩選小分子抑制劑：U937細(xì)胞經(jīng)400 μmol/L H2O2刺激4 h 后，分別與0.1 μmol/L Dex、1 μmol/L BEZ235/LY294002 單獨(dú)作用45 min，各孔給予20 ng/ml TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清，按照說(shuō)明書采用ELISA 檢測(cè)IL-8 的表達(dá)。各組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。③小分子抑制劑BEZ235/LY294002 聯(lián)合Dex：U937 細(xì)胞經(jīng)400 μmol/L H2O2刺激4 h 后，分別與 0.1 μmol/L Dex、1 μmol/L BEZ235/1 μmol/L LY294002 聯(lián)合作用45 min，各孔給予20 ng/ml TNF-α 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清，提取細(xì)胞RNA，ELI?SA 及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測(cè)各組IL-8 表達(dá)；提取細(xì)胞核蛋白和總蛋白，檢測(cè)核蛋白HDAC2活力及NF-κB、AP-1蛋白磷酸化水平。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 Real-time PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞 IL-8 mRNA 表達(dá)水平 用TRIzol 法提取各組細(xì)胞RNA，按照TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照PCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，最后計(jì)算各組細(xì)胞IL-8 mRNA 表達(dá)水平。所需引物序列如下：IL-8：（F）5'-TTGCCAAGGAGTGCTAAAGAA-3'，（R）5'-GCCCTCTTCAAAAACTTCTCC-3'；GAPDH：（F）5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'，（R）5'-TCTACACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'。

1.2.3 HDAC2活力的檢測(cè) 用碧云天核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核蛋白，然后按照HDAC2 Assay Kit說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞 NF-κB、AP-1 蛋白表達(dá)水平 以RIPA 裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度以保證蛋白質(zhì)量相同。SDS-PAGE電泳后，65 V 恒壓電轉(zhuǎn)蛋白至 PVDF 膜，BSA 封閉，滴加Jun、FOS 磷素化一抗（1∶1 000）、NF-κB 磷酸化一抗（1∶1 000）、GAPDH 一抗（1∶1 000）4℃ 孵育過(guò)夜，TBS 緩沖液漂洗后加HRP 二抗，室溫孵育1 h 后發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。采用Quantity One 軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)結(jié)果以表示。兩組間比較采用Studentt檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prisn7軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 Dex 對(duì) H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞的抑制作用減輕 TNF-α 可刺激 U937 細(xì)胞分泌 IL-8，H2O2+TNF-α聯(lián)合刺激，使得U937 分泌IL-8 的水平更高，為421.8 pg/ml。激素（Dex）可以抑制 TNF-α-U937 模型和H2O2-TNFα-U937模型中IL-8的分泌，但它使前者IL-8 分泌水平下降為73%，而使后者IL-8 分泌水平下降僅50%（圖1）。該結(jié)果提示H2O2是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，是活性氧（reactive oxygen species，ROS）成分的一種，細(xì)胞模型中添加H2O2可明顯增加細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的能力，并使細(xì)胞對(duì)Dex 的抑炎作用產(chǎn)生抵抗（圖1）。

圖1 TNF-α 刺激 Dex 預(yù)處理的 H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞時(shí)IL-8的表達(dá)Fig.1 Effects of TNF-α on IL-8 expression in H2O2-TNFα-U937 cell pre-incubated with Dex

2.2 單用PI3K 抑制劑不能明顯抑制H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞釋放IL-8 由上述實(shí)驗(yàn)可知H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞模型對(duì)Dex 的敏感性下降，有效模擬了重癥哮喘、吸煙哮喘患者PBMCs 的氧化應(yīng)激-激素耐受效應(yīng)。為了了解PI3K 抑制劑能否抑制H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞釋放 IL-8，將 Dex、PI3K 抑制劑BEZ235 或LY294002 分別與其單獨(dú)作用，檢測(cè)各組在TNF-α 刺激后的IL-8 表達(dá)水平（圖2）。結(jié)果顯示單用 Dex 可減少 H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞釋放 IL-8 水平約 55%，而 PI3K 抑制劑如 BEZ235 或 LY294002 單獨(dú)作用于H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞僅僅使得IL-8 的釋放減少23%、21%。說(shuō)明單用PI3K 抑制劑不能明顯抑制H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞釋放IL-8，不如單用Dex的抑制效果。

圖2 PI3K 抑制劑干預(yù)后 H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞的 IL-8 釋放情況Fig.2 Effects of PI3K inhibitor on IL-8 releasing in H2O2-TNFα-U937 cell

2.3 PI3K 抑制劑聯(lián)合Dex 明顯改善H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞模型對(duì)激素的不敏感性 為了進(jìn)一步驗(yàn)證 PI3K 抑制劑聯(lián)合 Dex 對(duì) H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞模型 的 作 用 ，將 Dex、PI3K 抑 制 劑 BEZ235+Dex 或LY294002+Dex 分別處理 H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞，檢測(cè)各組IL-8 分泌情況（圖3）。組間比較顯示BEZ235 或 LY294002 聯(lián)合 Dex 對(duì) IL-8 釋放的抑制作用，對(duì)比Dex 單用抑制55%的情況下，又有明顯降低。BEZ235+Dex 組、LY294002+Dex 組分別對(duì) IL-8的分泌抑制為86%、65%（vs H2O2-TNF-α組）。

圖3 PI3K 抑制劑聯(lián)合 Dex 干預(yù)后 H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞的IL-8釋放情況Fig.3 Effects of PI3K inhibitor plus Dex on IL-8 releas?ing in H2O2-TNFα-U937 cell

2.4 BEZ235聯(lián)合Dex可部分恢復(fù)H2O2-TNFα-U937細(xì)胞核蛋白HDAC2 活力 已知激素耐受與氧化應(yīng)激損害了HDAC2 活力有關(guān)，為了驗(yàn)證PI3K 抑制劑BEZ235 或LY294002 輔助Dex 減輕該模型激素不敏感是否與HDAC2活力改善有關(guān)，提取上述各組細(xì)胞核蛋白檢測(cè)其HDAC2 活力（圖4）。結(jié)果顯示H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞模型組較空白對(duì)照組HDAC2 活力顯著降低（P<0.01），說(shuō)明氧化應(yīng)激可損害U937 細(xì)胞核蛋白HDAC2 活力，在Dex 單獨(dú)處理后能部分恢復(fù)其 HDAC2 活力，但不顯著；BEZ235 聯(lián)合 Dex 可進(jìn)一步促進(jìn) HDAC2 活力恢復(fù)（vs H2O2組，P<0.05），Dex 聯(lián)合LY294002 與H2O2組相比無(wú)明顯差異。提示PI3K 的兩個(gè)抑制劑對(duì)HDAC2 活力恢復(fù)能力不同。BEZ235 聯(lián)合Dex 能更加有效地逆轉(zhuǎn)該模型核蛋白HDAC2活力，從而改善其對(duì)激素的敏感性。

圖4 Dex 或 PI3K 抑制劑聯(lián)合 Dex 對(duì) H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞核蛋白HDAC2活力的影響Fig.4 Effect of DEX or PI3K inhibitor combined with Dex on activity of nuclear protein HDAC2 in H2O2-TNFα-U937 cell

2.5 PI3K 抑制劑（BEZ235/LY294002）聯(lián)合Dex 可降低H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞中炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1 的磷酸化水平 為了探索BEZ235/LY294002聯(lián)合Dex 減輕H2O2-TNFα-U937 模型對(duì)激素不敏感的機(jī)制，通過(guò) Western blot 檢測(cè)各組 NF-κB 磷酸化水平及AP-1 亞基c-FOS 及c-Jun 蛋白磷酸化水平（圖5）。結(jié)果表明H2O2處理使炎癥轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、c-FOS、c-JUN）磷酸化水平顯著高于空白對(duì)照組（P<0.01）；Dex 單獨(dú)處理后 NF-κB 磷酸化水平無(wú)明顯變化，而 LY294002 聯(lián)合 Dex 能顯著抑制 NF-κB 磷酸化水平（P<0.01）；BEZ235 或 LY294002 聯(lián)合 Dex 均能顯著抑制c-FOS 和c-JUN 磷酸化水平（P<0.01）。提示BEZ235 或LY294002 能通過(guò)減輕相應(yīng)炎癥轉(zhuǎn)錄因子磷酸化水平來(lái)輔助Dex發(fā)揮抗炎作用。

圖5 PI3K 抑制劑聯(lián)合 Dex 對(duì) H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞炎癥轉(zhuǎn)錄因子磷酸化的影響Fig.5 Effects of PI3K inhibitor on phosphorylation of nuclear signal transcription factors in H2O2-TNFα-U937 cell

3 討論

氧化應(yīng)激是哮喘、COPD 等慢性氣道炎癥性疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一，也是激素治療不敏感的關(guān)鍵因素［2］。但激素不敏感的發(fā)生機(jī)制涉及多種途徑，目前仍沒(méi)有明確證據(jù)指明如何改善這一現(xiàn)象。本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)分離了重癥哮喘、輕中度哮喘和健康對(duì)照者的PBMCs，證實(shí)Dex 抑制重癥哮喘組PBMCs 釋放IL-8 的作用較后兩組明顯減弱（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。因此，建立H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞模型來(lái)模擬氧化應(yīng)激-激素耐受效應(yīng)，以求深入研究氧化應(yīng)激對(duì)慢性氣道炎癥激素不敏感的作用并探討改善途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2處理U937 細(xì)胞后，細(xì)胞釋放IL-8 明顯增多，對(duì)Dex 的抑炎作用產(chǎn)生了抵抗，提示H2O2引起的氧化應(yīng)激的確能損害細(xì)胞對(duì)激素的敏感性。

煙霧暴露哮喘小鼠模型表明，氧化應(yīng)激可激活PI3K 通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而降低激素敏感性，且PI3Kδ 和γ 是潛在的抗炎靶點(diǎn)［12］。因此本研究選取了 BEZ235 和 LY294002 兩種 PI3K 抑制劑對(duì) H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞模型進(jìn)行單獨(dú)干預(yù)，結(jié)果表明單用PI3K 抑制劑不能明顯抑制細(xì)胞釋放IL-8，甚至不如單用Dex。顯然單獨(dú)抑制PI3K 通路并不能有效抑制炎癥反應(yīng)，這可能與抑制IL-8 基因表達(dá)還需通過(guò)GC-糖皮質(zhì)激素受體（GR）復(fù)合物與IL-8基因相互作用實(shí)現(xiàn)有關(guān)，目前尚無(wú)證據(jù)能予以解釋。本研究進(jìn)一步采用上述兩種PI3K 抑制劑聯(lián)合Dex 對(duì)細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)兩種PI3K 抑制劑聯(lián)合Dex 能明顯改善細(xì)胞對(duì)激素的抵抗，與單用Dex 或PI3K 抑制劑相比有顯著差異。聯(lián)合Dex干預(yù)有效或許在一定程度上與本研究的假設(shè)符合，但具體原因需要更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。

組蛋白去乙酰化酶（HDACs）家族是一類細(xì)胞內(nèi)酶，可催化組蛋白賴氨酸去乙酰化來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，HDAC2 幾乎僅存在于細(xì)胞核中，是關(guān)閉活化的炎癥基因的關(guān)鍵核酶，因此，HDAC2 減少將引起炎癥過(guò)程放大［13］。研究表明氧化應(yīng)激能通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR 通路導(dǎo)致HDAC2 活力降低，與哮喘和 COPD 患者激素不敏感性的發(fā)生密切相關(guān)［7，14］。臨床研究也發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)氧化應(yīng)激水平高的重癥哮喘患者HDAC2活力明顯受損，而低濃度茶堿有望通過(guò)PI3Kδ 依賴機(jī)制將降低的HDAC2 活力恢復(fù)到正常水平，改善COPD、重癥哮喘和吸煙哮喘患者對(duì)激素的不敏感［15］。為了驗(yàn)證小分子抑制劑輔助Dex改善細(xì)胞對(duì)激素的不敏感性是否與HDAC2 活力改變有關(guān)，本研究檢測(cè)了細(xì)胞核蛋白HDAC2 活力，結(jié)果證實(shí)氧化應(yīng)激損害了U937 細(xì)胞核蛋白HDAC2 活力，Dex 單獨(dú)處理僅能部分恢復(fù)其HDAC2 活力，但并不顯著，與上述研究中Dex 對(duì)炎癥介質(zhì)釋放的抑制作用明顯減弱一致；BEZ235 聯(lián)合Dex 能進(jìn)一步促進(jìn)HDAC2 活力恢復(fù)，LY294002 聯(lián)合 Dex 與 H2O2組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，盡管該結(jié)果與LY294002 能改善激素抵抗的發(fā)現(xiàn)相矛盾，也許是由于LY294002作為非選擇性抑制劑，干預(yù)了其他通路導(dǎo)致其恢復(fù)HDAC2的活力受到了影響。

GC 的間接基因調(diào)控中，GR 結(jié)合HDAC2脫去乙酰基，使轉(zhuǎn)錄因子如 NF-κB 和 AP-1 失去功能，抑制炎癥基因轉(zhuǎn)錄［16］，因此本研究檢測(cè)了 BEZ235 或LY294002 聯(lián)合 Dex 對(duì) NF-κB、AP-1 磷酸化水平的影響，研究其改善激素不敏感性的機(jī)制。通過(guò)West?ern blot 分析，發(fā)現(xiàn) Dex 單獨(dú)處理后 NF-κB 磷酸化水平無(wú)明顯變化，BEZ235 或 LY294002 聯(lián)合 Dex 均能顯著抑制AP-1 磷酸化水平，但僅LY294002 聯(lián)合Dex 能顯著抑制 NF-κB 磷酸化水平，可見(jiàn) BEZ235 或LY294002 聯(lián)合Dex 改善激素不敏感性的調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，在輔助Dex 發(fā)揮抗炎作用的不同環(huán)節(jié)中存在著一定差異。LY294002 聯(lián)合Dex 雖不能恢復(fù)HDAC2 的活力，但能通過(guò)減少 NF-κB、AP-1 的磷酸化水平來(lái)輔助Dex 改善氧化應(yīng)激導(dǎo)致的激素不敏感，這也說(shuō)明激素不敏感的具體作用機(jī)制亟待后續(xù)的深入探索。

由于本研究細(xì)胞模型并非慢性氣道炎癥疾病患者的來(lái)源細(xì)胞，氣道炎癥環(huán)境又較為復(fù)雜，故在某些程度上存在局限性。但從一定意義上來(lái)說(shuō)，它是模擬重癥哮喘、吸煙哮喘患者PBMCs 對(duì)激素干預(yù)不敏感效應(yīng)的體外細(xì)胞工具。通過(guò)該細(xì)胞模型，本研究證實(shí)PI3K 抑制劑聯(lián)合Dex 可以通過(guò)恢復(fù)HDAC2活力和（或）抑制核信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，在體外改善H2O2-TNFα-U937 細(xì)胞模型對(duì)激素的不敏感性。PI3K 抑制劑是否能輔助激素治療因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的慢性氣道炎癥患者對(duì)激素的不敏感性還有待深入研究。