實驗性免疫性不育雄性小鼠濾泡輔助性T細胞相關細胞因子水平分析①

曹曉丹 魏任雄 張曉霞 周 俊 （浙江中醫藥大學附屬寧波中醫院男科實驗室，寧波315010）

不育癥日益受到社會的廣泛關注，我國約有15%~20%的育齡夫婦不能生育，男性因素約占50%［1-4］。免疫性不育是在某些外因或內因的誘發下，自身免疫耐受狀態被打破，持續遷延的自身免疫對自身抗原產生異常的免疫應答，導致免疫調節失衡，進而導致疾病發生。濾泡輔助性T（T follicular helper，Tfh）細胞由 IL-21 等誘導 Th0 分化產生，是真正意義上輔助B 細胞的一群新的CD4+Th 細胞亞群［5］。Tfh 細胞的產生和功能表達受多種因素調控。Bcl-6 等被認為是Tfh 細胞產生和分化的關鍵分子，IL-4、IL-21等細胞因子是Tfh細胞和B細胞狀態和功能的關鍵指標。本研究通過建立免疫性不育小鼠模型，分析免疫性不育小鼠與健康對照小鼠脾臟淋巴細胞中濾泡輔助性T細胞相關細胞因子變化，探討濾泡輔助性T細胞在免疫性不育發病過程中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級BALB/c小鼠，雄性，35只，6~8 周齡，體重16~18 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。對BALB/c 小鼠晝夜12 h 交替光照，自由食水，于室溫（23±1）℃條件下飼養。

1.1.2 儀器與試劑 IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 ELISA試劑盒（美國BioLegend公司）；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；APC 標記抗小鼠CD4 單克隆抗體、PerCP/Cy5.5 標記抗小鼠CXCR5 單克隆抗體、FITC 標記抗小鼠ICOS 單克隆抗體（美國eBioscience 公司）；小鼠抗精子抗體檢測試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司）；iMark 酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；ABI 7500 PCR 儀（美國ABI 公司）；FACSCanto Ⅱ流式細胞計數儀（美國BD公司）。qPCR 特異引物由Primer5 軟件設計（表1），上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-17、IL-21基因引物序列Tab.1 Primer sequences of Bcl-6，IL-4，IL-12，IL-17，IL-21

1.2 方法

1.2.1 免疫性不育小鼠模型的建立 每次免疫前取雄性BALB/c小鼠5只，共3次，CO2安樂死后取雙側睪丸組織，用生理鹽水沖洗，置于M199 獲能液中，剪碎，37℃ 靜置15 min，尼龍網（孔徑200μm）過濾，37℃ 培育 1.5 h，調整精子數為 2.0×106個/ml，加入完全弗氏佐劑，研磨混勻作為抗原。

取雄性BALB/c 小鼠20 只，隨機分為正常組和實驗組（10 只/組）。實驗組雙側腹股溝頸背部脊柱兩側皮下多點注射0.5 ml 抗原作為首次免疫，10 d后于上述相同部位加強免疫。正常組注射生理鹽水。分別于初免前及每次加強免疫后眼眶靜脈采血，分離血清，ELISA 檢測血清抗精子抗體（anti-sperm antibody，AsAb）。第 3 次加強免疫后檢測小鼠血清AsAb 水平，篩選AsAb 陽性的小鼠進行后續研究。

1.2.2 小鼠脾臟淋巴細胞的分離 小鼠經CO2安樂死后，用75%的乙醇浸泡2~3 min，減少毛發造成的污染。將小鼠移入超凈工作臺，在無菌條件下，以仰臥位固定于解剖盤。采用眼科鑷子夾起腹股溝中線處皮膚，眼科剪做一橫切口。鑷子捏住切口兩端皮膚，向小鼠的尾部和頭部縱向撕開皮膚，暴露腹腔膜壁，乙醇消毒。切開腹腔壁膜，采用鑷子夾住脾臟，剪刀剪去與其相連的組織。將分離得到的脾臟組織浸泡于干凈的PBS 溶液；在培養皿中加入適量PBS溶液，放置細胞篩，將脾臟取出置于細胞篩。取干凈的注射器，用其按壓處末端碾壓組織。膜內細胞會慢慢游離出來，經過細胞篩后，懸浮于培養皿溶液。洗滌細胞篩，收集細胞篩外PBS 至50 ml 離心管，400 g 離心 15 min，去上清；加紅細胞裂解液 2 ml，重懸，37℃ 靜置 2 min 后，400 g 離心15 min，加入 5 ml PBS 洗滌，400 g 離心，去上清；加入5 ml PBS重懸，除去其中不可溶的組織纖維，懸浮液取10 μl細胞計數，調整細胞密度為1×106個/ml。

1.2.3 流式細胞術檢測小鼠脾淋巴細胞內Tfh 細胞的比例［6］取1×106個上述方法分離獲得的脾淋巴細胞，PBS 洗滌 2 次，4℃、1 000 r/min 離心 5 min。取100μl PBS 重懸細胞，分別加入APC 標記抗小鼠CD4 單克隆抗體、PerCP/Cy5.5 標記抗小鼠CXCR5單克隆抗體、FITC 標記抗小鼠ICOS 單克隆抗體各5 μl，混勻后4℃ 避光孵育30 min。4℃、1 000 r/min離心 5 min，棄上清，PBS 洗滌后重懸細胞，PBS 稀釋至300~500μl，流式細胞儀檢測。

1.2.4 qRT-PCR 檢測免疫性不育小鼠脾淋巴細胞中 Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 水平 按照 Trizol試劑盒說明書提取脾淋巴細胞總RNA，并進行去除基因組 DNA 及反轉錄反應。Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 和內參基因GAPDH 的核酸序列通過基因庫（Gene Bank）獲得。反應體系采用SYBR Green 熒光染料法，避光操作，每個反應重復3 孔，在ABI 7500 PCR 儀上對轉錄因子和不同細胞因子轉錄水平進行檢測，反應條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃34 s，共進行個循環。

1.2.5 ELISA 檢測小鼠血清中 IL-4、IL-12、IL-17、IL-21水平 小鼠眼眶靜脈采血，離心收集血清。待測樣品孔中每孔分別加入待測血清100μl，所有樣品均作復孔，反應板于37℃下孵育120 min。用300 μl 1×Wash Buffer 洗板 4~6 次，每個測試孔中分別加入IL-4、IL-12、IL-17、IL-21一抗工作液各50 μl，將反應板充分混勻后于37℃孵育60 min。洗板后，各測試孔加酶標抗體工作液100 μl，反應板于37℃孵育60 min。孵育結束后洗板，之后每孔加入底物液100 μl，置暗處反應5~10 min。每孔加入50 μl 終止液混勻。酶標儀檢測450 nm 處每個孔的吸光值，根據標準品計算樣品的濃度。

1.3 統計學分析 采用Graphpad Prism 5軟件進行統計學分析。所有數據以表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫性不育小鼠模型的建立 對第3 次加強免疫后的小鼠血清進行AsAb 檢測，結果顯示，實驗組小鼠血清吸光度值為0.45±0.04，對照組小鼠血清吸光度值為0.18±0.01。實驗組10 只小鼠AsAb吸光度/正常對照組≥2.1，即為AsAb（+）。

2.2 小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CXCR5+ICOS+T 細胞表達水平 將分離的脾臟淋巴細胞進行多色免疫熒光標記，以CD4+CXCR5+ICOS+作為Tfh 的標志進行分析。免疫性不育小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CXCR5+ICOS+T 細胞比例明顯高于正常對照組（P<0.001，圖1）。

圖1 小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CXCR5+ICOS+T 細胞的比例分析Fig.1 Analysis of proportion of CD4+CXCR5+ICOS+T cells in spleen lymphocytes of mice

2.3 小鼠脾臟淋巴細胞中 Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 mRNA 相對表達量 與對照組相比，免疫性不育小鼠脾臟淋巴細胞Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-21 mRNA 含量升高，差異有統計學意義（P<0.05），IL-17 mRNA 含量變化無統計學差異（P>0.05）。見圖2。

圖2 小鼠脾臟淋巴細胞中Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 mRNA相對表達量Fig.2 mRNA relative expression levels of Bcl-6，IL-4，IL-12，IL-17，IL-21 in spleen lymphocytes of mice

2.4 小鼠血清中IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 水平 與對照組相比，免疫性不育小鼠血清中IL-4、IL-12、IL-21 的含量升高（P<0.05），IL-17 含量變化差異無統計學意義（P>0.05，圖3）。

圖3 小鼠血清中IL-4、IL-12、IL-17、IL-21水平Fig.3 Serum levels of IL-4，IL-12，IL-17，IL-21 in mice

3 討論

前期研究認為Th1/Th2 細胞亞群的失衡和免疫性不育的發生有關［7］。在免疫系統中，初始CD4+T 淋巴細胞（Th0）在局部微環境中受不同細胞因子調控向不同方向分化，其分化方向決定免疫應答的類型。IL-21 和 IFN-γ 等可誘導 Th0 向 Th1 分化，主要介導細胞免疫應答。IL-4 等可誘導Th0 向Th2 分化，主要介導體液免疫應答。TGF-β 和IL-2可誘導Th0 向Treg 分化，主要發揮免疫抑制和免疫調節作用。TGF-β 和 IL-6（小鼠）或 IL-1β 和 IL-6（人）等可誘導Th0 向Th17 分化，主要通過分泌IL-17 刺激多種細胞參與機體的免疫防御，在固有免疫中發揮重要作用。由于Th2細胞分泌的IL-4等細胞因子能夠誘導B 細胞活化、增殖及抗體產生，因此Th2 細胞一直被認為是輔助B 細胞的主要輔助性T細胞，但實驗發現IL-4 基因敲除小鼠并不影響抗體的產生［8］。Tfh 細胞由 IL-21 等誘導 Th0 分化產生，是真正意義上輔助B 細胞的一群新的CD4+Th 細胞亞群。Tfh 細胞輔助B 細胞在生發中心存活、增殖，促進B細胞向漿細胞分化、抗體類別轉換，在自身免疫性疾病中扮演重要角色［9］。

Tfh 細胞的產生和功能表達受多種因素調控。轉錄因子B 細胞淋巴瘤6（B cell lymphoma 6，Bcl-6）是Tfh 細胞特異性的轉錄因子，是區別于Th1、Th2、Th17 等輔助性T細胞的特征之一，在Tfh 的分化、特異性表面分子的表達及T細胞依賴的生發中心免疫應答中起關鍵作用［10］。研究顯示，Bcl-6 缺陷的小鼠體內不能形成生發中心，Tfh 細胞發育障礙，且不能對胸腺依賴的抗原產生免疫應答［11］。本研究采用RT-PCR 方法檢測免疫性不育小鼠脾臟淋巴細胞中Bcl-6 的mRNA 水平，結果顯示，在免疫性不育小鼠中，Bcl-6 的表達顯著高于健康對照小鼠。流式檢測結果顯示，免疫性不育小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CXCR5+ICOS+Tfh 細胞比例明顯高于正常對照組。實驗結果提示免疫性不育小鼠脾臟淋巴細胞中Bcl-6 的升高可誘導初始T 細胞向Tfh 分化，從而增加免疫性不育小鼠中Tfh 的數量。

免疫微環境中的相關細胞因子，如IL-12、IL-21等可促進初始 CD4+T 細胞分化為 Tfh 細胞［12-13］。IL-21 是Tfh 細胞的重要功能性細胞因子，具有強大的輔助誘導功能，IL-21 可通過與B 細胞表面受體結合促進B 細胞高頻突變、Ig 類別轉化及漿細胞形成［14-15］。IL-21受體（IL-21 receptor，IL-21R）表達在B細胞、T 細胞和NK 細胞表面，其中B 細胞是其作用的最主要的靶細胞。通過自分泌的方式，IL-21 能促進Tfh 自身的分化，同時影響Tfh 細胞轉錄因子Bcl-6的表達［16］。高表達IL-21 的小鼠漿細胞數目顯著上升，而在IL-21 缺失或IL-21R 缺陷的小鼠中，T細胞依賴型抗體的分泌發生障礙，提示IL-21 為B細胞分化及類別轉換的重要細胞因子，在B 細胞對T 細胞依賴抗原的免疫應答及體液免疫的長期維持中發揮重要作用［17］。在本研究中，免疫性不育小鼠脾臟淋巴細胞中IL-4、IL-12、IL-21 mRNA 的表達顯著升高，兩組間IL-17 的表達差異無統計學意義。ELISA 法檢測血清中 IL-4、IL-12、IL-21、IL-17 的水平，得到了同樣的結果。推測在免疫性不育的發生過程中，大量炎癥細胞及免疫細胞被活化，產生大量 IL-4、IL-12 及 IL-21，導致免疫微環境紊亂，使CD4+Th 細胞向Tfh 細胞分化、增殖。本研究闡明了Tfh 細胞相關細胞因子在免疫性不育小鼠發病中的表達特征及意義，為后續Tfh 細胞在輔助免疫性不育機體B細胞分泌自身抗體過程中具體作用及機制的研究奠定基礎。