圣草酚通過調(diào)節(jié)Nrf2通路促進氧化應激誘導的肝癌細胞的凋亡①

張昆鵬 張曉愉 李少一 甄 品 尤江蓮 （邢臺市人民醫(yī)院，邢臺054001）

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥死亡率中居第四位，是我國第二大健康負擔［1］。通常所用的化療法可以在某種程度上殺死癌細胞，但副作用給患者帶來了很多麻煩。它會導致電解質(zhì)失衡，脫水和營養(yǎng)不良，從而影響患者的生活質(zhì)量，這使得對新藥的需求變得迫在眉睫［2］。癌細胞逃脫凋亡的機制在腫瘤學研究中引起廣泛關注，利用藥物誘導腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的重要途徑之一［3］。凋亡由多種外在和內(nèi)在信號觸發(fā)，包括可能誘導某些促凋亡蛋白活化的各種細胞應激或細胞毒性藥物，在這多種因素中，由ROS 驅(qū)動的氧化應激誘導細胞凋亡備受關注。氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)是維持正常細胞功能和促進細胞存活的基礎［4］。伴隨著比正常細胞更高的ROS 水平，癌細胞特征性地發(fā)展出幾種適應性反應，以維持與細胞生物學功能兼容的ROS 水平。因此，認為對ROS 穩(wěn)態(tài)的干擾能夠破壞癌細胞的生物代謝并有效地誘導癌細胞凋亡［5］。圣草酚是一種天然的多酚黃酮類化合物，在水果、蔬菜和多種中藥中普遍存在。圣草酚具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛和神經(jīng)保護等作用［6］。已有研究表明，圣草酚通過誘導線粒體介導的凋亡，G2/M 細胞周期阻滯和抑制m-TOR/PI3K/Akt 信號通路，對人肺癌A549 細胞發(fā)揮有效的抗癌活性［7］。雖已有研究表明圣草酚可誘導肝母細胞瘤HepG2 細胞凋亡，但高分化肝癌Huh7細胞株與肝母細胞瘤HepG2細胞具有不同分泌物：Huh7細胞系能產(chǎn)生一些細胞質(zhì)蛋白，如白蛋白、a 抗胰蛋白酶、AFP 等；HepG2 細胞系可分泌ALB、a2-MG 等。因此，Huh7 細胞更適合用于肝細胞代謝方面的研究。故，圣草酚是否對高分化肝細胞肝癌Huh7 細胞凋亡具有作用尚不明確［8］。本文選取高分化肝細胞肝癌Huh7細胞株，通過體外細胞實驗和體內(nèi)移植瘤實驗來探究圣草酚對氧化應激誘導的肝癌細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 肝細胞HL-7702 和人肝癌細胞Huh7（上海通派生物科技有限公司）；圣草酚（HLPC≥99%，上海葉原生物科技有限公司，貨號：B29144），過氧化氫（純度≥98%，上海百舜生物科技有限公司，貨號：7722-84-1）；蓽茇酰胺（Piperlongumine，PL，可增加活性氧的水平，HLPC≥99%，上海藍木化工有限公司，貨號：S7551）；DMEM培養(yǎng)基（上海慧穎生物科技有限公司，貨號：C21700500BT）；CCK-8 試劑盒（上海艾博抗生物科技有限公司，貨號：ab228554）；胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液（上海素爾生物科技有限公司，貨號：16000-044、15140122）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA 試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司，貨號：EELR1424）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA 試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，貨號：SBJR0007）；BCA 試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司，貨號：BC201）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、Nrf2、HO-1、NOQ1 兔來源的單克隆抗體（上海艾博抗生物科技有限公司，貨號：ab36151、ab62352、ab189491、ab80588）。

1.1.2 動物 6 周齡的裸鼠購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2018-004。將裸鼠飼養(yǎng)在恒溫（22±1）℃、相對濕度（55±5）%、12 h 光照/黑暗周期環(huán)境，并提供標準的嚙齒動物食物和自來水。動物的護理和處理符合美國國立衛(wèi)生研究院編寫的《實驗動物的護理和使用指南》。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 肝細胞HL-7702 和人肝癌細胞Huh7均在含體積分數(shù)為10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml 的鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8 法測定圣草酚對細胞的毒性影響 將HL-7702 和Huh7 細胞分別接種到96 孔板中，用不同濃度的圣草酚處理培養(yǎng)48 h 后，將細胞與10 μl CCK-8 試劑連續(xù)混合2 h。通過酶標儀測量450 nm 處的吸光度值。細胞活性=（各濃度圣草酚處理OD450n/m0μmo/l L圣草酚處理OD450nm）×100%。

1.2.3 細胞分組及處理 將Huh7 細胞分為對照組、H2O2組、圣草酚組、H2O2+圣草酚組，分別用0.5 mmo/l L H2O2或78μmo/l L圣草酚處理細胞48 h。

1.2.4 體內(nèi)實驗 將裸鼠隨機分為對照組、PL 組、圣草酚組、PL+圣草酚組，每組8 只。在裸鼠左腋下皮下注射 Huh7 細胞（5×104個/ml），繼續(xù)在 SPF 條件下正常飲食飼養(yǎng)。當Huh7腫瘤直徑達到約3 mm時，每天腹腔注射PL 2.5 mg/kg或圣草酚40 mg/kg治療15 d［9-10］。頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，測定移植瘤體積和重量。

1.2.5 DCFH-DA探針測定ROS的含量 將細胞用DMEM 洗滌 2 次，然后在 5 μmo/l L DCFH-DA 中于37℃溫育30 min。用PBS 洗滌細胞3 次，并在孵育后在裂解緩沖液中裂解。在最佳激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長下527 nm 測量熒光值。ROS 相對水平=各實驗組熒光值/對照組熒光值。

1.2.6 試劑盒檢測SOD 和MDA 水平 收集1.2.3處理細胞，加入PBS 冰上超聲裂解細胞，然后再置于4℃離心機中，12 000 g 離心10 min，收集上清液備用。收集1.2.4 各組裸鼠血液，于4℃離心機中，3 000 g離心20 min，收集上清液備用。取Huh7細胞上清液和裸鼠血清按照SOD 和MDA 試劑盒說明檢測SOD和MDA水平。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取1.2.3處理細胞培養(yǎng)24 h后，離心收集細胞，并按1×106個/ml的濃度重懸。細胞懸液中加入5 μl FITC 標記的膜聯(lián)蛋白V和5μl 碘化丙啶，避光孵育15 min，然后用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.8 Western blot 檢測 Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白相對表達水平 用RIPA 裂解液提取總蛋白，并用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，然后經(jīng)SDS-PAGE 分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF 膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入兔來源的單克隆一抗（Nrf2 1∶1 000、HO-1 1∶1 500、NQO1 1∶800、GAPDH 1∶1 000）在4℃封閉過夜，加入對應山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫封閉1 h，最后滴電化學反應液曝光，以GAPDH 為內(nèi)參，使用Quantity One 軟件進行分析蛋白條帶灰度，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH吸光度比值表示蛋白的表達水平。

1.2.9 TUNEL 染色檢測細胞凋亡 取腫瘤組織固定后，常規(guī)石蠟切片，玻片預先用多聚賴氨酸處理以防止脫片。切片脫蠟入水后按TUNEL 染色試劑盒使用說明操作，DAB 染色，常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下檢查。棕褐色細胞代表凋亡細胞。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS20.0處理，圖形使用GraphPad Prism 6.0 構建的。實驗數(shù)據(jù)以表示，數(shù)據(jù)經(jīng) shapiro-wilk 檢驗發(fā)現(xiàn)均呈正態(tài)分布，多組比較進行One-Way ANOVA 分析，兩兩比較使用SNK檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 圣草酚對HL-7702和Huh7細胞毒性作用 結(jié)果顯示，圣草酚呈劑量依賴性抑制HL-7702 和Huh7細胞活性。相同濃度的圣草酚對Huh7 細胞抑制作用比HL-7702抑制作用強，且隨著濃度增加，差異越顯著，這說明圣草酚對肝癌細胞具有選擇抑制作用。Huh7 細胞圣草酚 IC50為 126.58 μmo/l L，HL-7702 細胞圣草酚 IC10為 77.96 μmo/l L，因此選擇對正常肝細胞HL-7702 無毒害作用的圣草酚濃度78μmo/l L進行后續(xù)細胞實驗，如圖1。

圖1 通過CCK-8法檢測圣草酚對HL-7702和Huh7細胞毒性作用Fig.1 Cytotoxic effect of Eriodictyol on HL-7702 and Huh7 cells by CCK-8 method

2.2 圣草酚對H2O2誘導Huh 7 細胞氧化應激水平的影響 與對照組相比，H2O2組和圣草酚組ROS 水平和MDA 含量顯著上升，SOD 活性顯著下降（P<0.05）；與 H2O2組相比，H2O2+圣草酚組 ROS 水平和MDA 含量顯著上升，SOD 活性顯著下降（P<0.05），如圖2。這說明圣草酚可改變肝癌細胞Huh7 氧化應激水平。

圖2 圣草酚對H2O2誘導Huh7細胞氧化應激水平的影響Fig.2 Effect of Eriodictyol on H2O2-induced oxidative stress in Huh7 cells

2.3 圣草酚對H2O2誘導Huh7 細胞凋亡的影響 與對照組相比，H2O2組和圣草酚組細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與H2O2組相比，H2O2+圣草酚組細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），如圖3。這說明圣草酚促進氧化應激誘導肝癌Huh7細胞凋亡。

圖3 流式細胞術檢測圣草酚對H2O2誘導Huh7細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Eriodictyol on H2O2-induced apoptosis in Huh7 cells was examined by flow cytometry

2.4 圣草酚對H2O2誘導Huh7 細胞Nrf2 通路的影響 如圖4 所示：與對照組相比，H2O2組和圣草酚組細胞中核 Nrf2、HO-1、NOQ1 表達顯著下調(diào)（P<0.05）；與 H2O2組相比，H2O2+圣草酚組細胞中核Nrf2、HO-1、NOQ1 表達顯著下調(diào)（P<0.05）。這說明圣草酚抑制Nrf2通路激活。

圖4 Western blot 檢測圣草酚對H2O2誘導Huh7 細胞Nrf2通路的影響Fig.4 Effect of Eriodictyol on H2O2-induced Nrf2 path?way in Huh7 cells was detected by Western blot

2.5 圣草酚對肝癌Huh 細胞移植瘤的影響 與對照組相比，PL 組和圣草酚組移植瘤體積和重量顯著降低，ROS水平和MDA含量顯著增加，SOD活性顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，Nrf2、HO-1、NOQ1表達顯著下調(diào)（P<0.05）；與PL組相比，PL+圣草酚組移植瘤體積和重量顯著降低，ROS水平和MDA 含量顯著增加，SOD 活性顯著降低，細胞凋亡率顯著增多，核Nrf2、HO-1、NOQ1 表達顯著下調(diào)（P<0.05），如圖5。這說明圣草酚促進氧化應激誘導的肝癌移植瘤細胞的凋亡，并抑制Nrf2通路激活。

圖5 圣草酚對肝癌Huh7細胞移植瘤的影響Fig.5 Effect of Eriodictyol on liver cancer Huh7 cell transplanted tumor

3 討論

盡管在診斷和治療方面取得了進步，但全世界肝癌的發(fā)病率仍在逐年上升，肝癌患者五年生存率仍然很低。因此，迫切需要更有效的治療來提高肝癌患者的生活質(zhì)量。化療藥物廣泛用于提高癌癥患者的存活率，但這些藥物顯示出各種各樣的副作用。化療藥物在癌癥治療中的主要策略是誘導細胞凋亡。因此，開發(fā)新的促進肝癌細胞凋亡的藥物勢在必行。圣草酚通過PI3K/Akt/NF-κB 信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移，誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡［11］。本研究結(jié)果表明，圣草酚選擇性抑制肝癌細胞的活性。同時還證明，低毒性的圣草酚促進氧化應激誘導的肝癌細胞和移植瘤細胞的凋亡，并抑制Nrf2通路激活。

細胞凋亡是指細胞為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主有序的死亡，絕大多數(shù)腫瘤細胞都具有逃脫凋亡的能力。許多蛋白包括細胞表面受體、配體、蛋白酶和有絲分裂組分，調(diào)節(jié)著細胞的生存與凋亡的平衡［12］。有研究表明，圣草酚誘人肝癌細胞抗癌和凋亡作用與細胞周期阻滯和凋亡相關蛋白的調(diào)節(jié)有關［13］。氧化應激通過線粒體、死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等途徑介導細胞凋亡［14］。ROS包括超氧自由基、羥基自由基和過氧化氫，都是通過細胞過程（如線粒體代謝）的產(chǎn)物。PL 為促氧化藥物，可以增加ROS 水平，目前可用于選擇性地殺死癌細胞［15］。ROS 的產(chǎn)生與抗氧化劑系統(tǒng)清除自由基的能力之間的不平衡會導致氧化應激。正常細胞中會產(chǎn)生細胞內(nèi)ROS，以調(diào)節(jié)一系列生理功能，包括炎癥、免疫反應和細胞信號傳導，從而促進病原體和致癌物的消除，降低心血管疾病的發(fā)生和甲狀腺激素的生物合成等［16］。過量的ROS 水平則會對細胞產(chǎn)生嚴重的氧化應激，導致細胞成分（如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)）受損，并最終導致細胞死亡［17］。本研究表明，圣草酚可升高H2O2誘導的Huh7細胞和PL 處理的Huh7 細胞移植瘤中ROS 水平和MDA 含量，降低SOD 活性。實際上，膜脂質(zhì)的過氧化被認為是破壞氧化應激的首要目標，MDA 是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物［18］。SOD 是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除機體內(nèi)氧自由基［19］。同時，本研究還表明，圣草酚可升高H2O2誘導的Huh7 細胞和PL處理的Huh7 細胞移植瘤細胞凋亡率。這說明圣草酚促進氧化應激誘導的肝癌Huh7 細胞凋亡，這與圣草酚可誘導肝癌HepG2 細胞的凋亡結(jié)果相一致［8］。

Nrf2信號傳導途徑是細胞防御系統(tǒng)最關鍵的途徑之一，該途徑調(diào)節(jié)了許多可以抵消氧化應激的抗氧化劑和細胞保護性基因的轉(zhuǎn)錄［20］。如，低聚原花青素通過Nrf2-ARE 途徑保護A549細胞免受H2O2誘導的氧化應激［21］。Nrf2 表達于細胞質(zhì)中，其在細胞核中的積累和激活有利于氧化損傷，也有利于癌細胞，是細胞氧化應激反應的關鍵因素［22］。在氧化應激期間，會激活復雜的氧化應激響應系統(tǒng)。特別是，Nrf2 暴露于親電試劑或ROS 中，可以誘導一系列保護性蛋白，例如 HO-1 和 NQO1［23］。本研究表明，圣草酚抑制細胞核Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達，說明圣草酚促進氧化應激誘導的肝癌細胞和移植瘤細胞的凋亡與抑制Nrf2通路激活有關。

綜上所述，圣草酚促進氧化應激誘導的肝癌細胞和移植瘤細胞的凋亡，并抑制Nrf2 通路激活，說明圣草酚具有治療肝癌的潛在能力。但是本文僅是相關機制的初步探討，具體的分子通路機制仍需進一步探討。