TrxR抑制劑AA1激活抗腫瘤免疫抑制胃癌進展的實驗研究

范有壽 邱志勝 趙亞萍 （金昌市第一人民醫院外一科，金昌737100）

胃癌是常見消化系統惡性腫瘤，是全球第四大常見惡性腫瘤，轉移率、發病率和死亡率較高［1］。我國每年胃癌患者死亡人數高達49.8萬，病死率位居所有惡性腫瘤第三［2-3］。胃癌早期發病特征不明顯，多數到醫院治療的患者已是中晚期，給家庭和社會帶來沉重負擔［4］。因此，胃癌防控是急需解決的熱點問題。

硫氧還蛋白氧化還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）是存在于細胞中的含硒同型二聚體黃素酶，其主要功能為調節氧化還原平衡，與細胞增殖、凋亡及腫瘤發生、轉移、血管生成密切相關［5］。氯（三乙基膦）金（Ⅰ）［Chloro（triethylphosphine）gold（Ⅰ），AA1］是一種TrxR 抑制劑，屬于含金的烷基試劑，其作用原理與順鉑類似，最終導致DNA 損傷促進細胞凋亡［6-7］。研究顯示，AA1 對 TrxR 的抑制作用較強，通過抑制TrxR 活性誘導細胞凋亡［6］。但AA1 激活抗腫瘤免疫抑制胃癌進展的作用及機制未見報道。本研究擬構建荷瘤小鼠胃癌模型，觀察TrxR 抑制劑AA1 對胃癌腫瘤及小鼠免疫功能相關生物學行為的影響，為進一步探討其可能作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 鼠源胃癌MFC 細胞株購自上海弘順生物科技有限公司。將鼠源胃癌MFC 細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基，37℃、5%CO2培養，顯微鏡下觀察，長成單層細胞時傳代。

1.1.2 實驗動物 SPF 級C57BL/6J 小鼠，雄性，4 周齡，體重（20.0±2.0）g，購自浙江醫學科學院動物研究中心，合格證號：SCXK（浙）2015-0033。動物實驗經我院實驗動物倫理委員會批準。

1.1.3 主要試劑 DMEM 細胞培養基（美國Hy?clone 公司）；胎牛血清（美國Gibco 公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malo?ndialdehyde，MDA）試劑盒（英國Abcam 公司）；小鼠CD4+-APC、CD8+-PE流式試劑盒、淋巴細胞亞群檢測試劑盒（美國BD eBioscience 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；兔抗鼠c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體、羊抗兔二抗（美國Cell signaling公司）。

1.1.4 儀器 FA1004N 電子天平（上海民橋精密儀器有限公司）；高速冷凍離心機（Thermo Scientific公司，美國）；SpectraMax iD5-多功能酶標儀（美谷分子儀器有限公司）；FCM 凝膠成像系統（Protein Sim?ple 公司，美國）；Bio-Rad 電泳儀、Attune NxT 流式細胞儀（Thermo Fisher公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 20 只SPF 級 C57BL/6J 小鼠隨機分為對照組、AA1 組（實驗組），每組10 只。根據前期預實驗及文獻［8-9］構建荷瘤小鼠模型（注射給予鼠源胃癌MFC 細胞），造模后第7 天，游標卡尺測量腫瘤體積，>100 mm3為建模成功。給予AA1治療（25 mg/kg），每隔2 d 重復給藥1 次，共7 次，對照組給予等體積PBS。從給藥開始第1 天，每天測量腫瘤體積，給藥7 次后（第13 天）剝離腫瘤組織，觀察腫瘤形態并記錄腫瘤質量。

1.2.2 MDA、SOD 含量測定 末次給藥后，采集荷瘤小鼠外周血，采用ELISA 法檢測2 組小鼠外周血中MDA、SOD含量。

1.2.3 流式細胞術檢測CD4+、CD8+細胞水平和NK細胞數 荷瘤小鼠取眼球外周血，加入荷瘤小鼠淋巴細胞分離液分離，分別加入APC anti-CD4、PE an?ti-CD8 和 PE anti-NK cell 抗體，混勻，40℃ 避光孵育30 min，標記細胞表面抗原CD4、CD8、NK細胞染色，離心5 min，棄上清，加入PBS 1.5 ml混勻，重復離心5 min，棄上清，加入0.5 ml PBS 重懸，置于離心管，流式細胞術檢測，分別比較2 組外周血CD4+、CD8+細胞水平及NK細胞數。

1.2.4 Western blot 檢 測 JNK 及 p-JNK 蛋白水平 取腫瘤組織液氮中研碎，加入RIPA 裂解液（1∶10），BCA 試劑盒測定腫瘤組織總蛋白含量。經SDS-PAGE 電泳分離，轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，TBST 洗滌液漂洗3~4 次。加入一抗，4℃ 孵育過夜，漂洗3~4 次，加入HRP 標記的二抗，室溫孵育2 h，漂洗3~4 次，化學發光檢測底物ECL 工作液顯色，采用Image J 圖像分析系統對蛋白顯影圖進行灰度分析，分別考察2 組荷瘤小鼠腫瘤組織中JNK、p-JNK蛋白表達水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量數據采用表示，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體內AA1 治療抑制胃癌進展 以AA1 治療第1 天為起點，治療期間測量2 組小鼠腫瘤體積，AA1組腫瘤體積明顯小于對照組（P<0.05，圖1A），治療后第13 天處死小鼠，剝離腫瘤組織（圖1B），測量2組腫瘤質量，AA1組腫瘤質量顯著低于對照組（P<0.05，圖1C）。

圖1 AA1對荷瘤小鼠胃癌進展的影響Fig.1 Effect of AA1 on progress of gastric cancer in tu?mor-bearing mice

2.2 AA1 治療對MDA、SOD 表達的影響 取荷瘤小鼠外周血，檢測MDA、SOD含量，AA1組小鼠MDA含量明顯低于對照組，SOD 含量明顯高于對照組（P<0.05，圖2）。

圖2 AA1對MDA、SOD表達的影響Fig.2 Effect of AA1 on expressions of MDA and SOD

2.3 AA1 對外周血 CD8+、CD4+、NK 細胞數的影響 如表1、圖3所示，取荷瘤小鼠眼球外周血，檢測外周血 CD4+、CD8+、NK 細胞數，AA1 組小鼠外周血CD4+、NK 細胞數顯著多于對照組，而CD8+細胞數顯著少于對照組（P<0.05）。

表1 AA1對CD8+、CD4+、NK細胞表達的影響（，%）Tab.1 Effect of AA1 on expressions of CD8+，CD4+and NK cells（，%）

表1 AA1對CD8+、CD4+、NK細胞表達的影響（，%）Tab.1 Effect of AA1 on expressions of CD8+，CD4+and NK cells（，%）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05.

AA1 23.91±1.041）16.34±1.231）16.08±0.711）Groups CD4+CD8+NK Control 14.18±0.95 21.34±1.12 9.48±0.57

圖3 AA1對CD8+、CD4+、NK細胞表達的影響Fig.3 Effect of AA1 on expressions of CD8+，CD4+ and NK cells

2.4 AA1 對JNK 通路的影響 2 組小鼠腫瘤組織中JNK 蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05），AA1組p-JNK表達顯著高于對照組（P<0.05，圖4）。

圖4 2組JNK及p-JNK蛋白表達比較Fig.4 Comparison of JNK and p-JNK proteins expres?sions between two groups

3 討論

TrxR 為存在于細胞中的含硒同型二聚體黃素酶，具有抗氧化防御、細胞增殖、凋亡以及腫瘤發生、轉移、血管生成等作用，有望成為藥物的潛在治療靶點［5，10］。譚強等［11］研究發現，肝癌小鼠 TrxR 活性與腫瘤生長呈正相關。雷虹［7］給予肝癌患者TrxR抑制劑AA1 治療，抗腫瘤活性較好。TrxR 對亞硫氰酸的選擇性代謝可促進肺天然免疫和抗氧化防御［12］。本研究采用體內動物實驗驗證TrxR 抑制劑AA1 對胃癌荷瘤小鼠的抗癌作用及免疫調節機制，結果顯示，AA1 組小鼠腫瘤體積明顯小于對照組，腫瘤組織明顯減小，腫瘤質量顯著降低，說明TrxR抑制劑AA1可抑制荷瘤小鼠胃癌發生發展。

在胃癌發生發展機制中，細胞因子發揮一定調控作用［13］。SOD 水平改變可導致還原型復合物濃度下降，進而提高胃黏膜上皮細胞損傷風險，促進腫瘤細胞早期異常分裂。MDA 是氧化型復合物，可通過誘導游離自由基形成增強游離自由基對胃黏膜上皮細胞的浸潤和損傷程度，進而促進消化道腫瘤進展［14-15］。本研究發現，AA1 組小鼠 MDA 含量明顯低于對照組，SOD 含量明顯高于對照組，可見TrxR抑制劑AA1可提高荷瘤小鼠抗氧化能力。

研究顯示，中晚期胃癌患者外周血T 細胞免疫功能低下的原因可能與腫瘤發生、發展相關［16］。在腫瘤抗原刺激下，脾細胞免疫抑制細胞前體被激活，分泌免疫抑制因子，抑制機體免疫細胞活性，導致胃癌患者機體免疫功能低下［17］。而機體總的免疫功能狀況可由 CD4+和 CD8+T 淋巴細胞反應［18］。CD4+T細胞為輔助/誘導性T細胞，可輔助體液免疫及細胞免疫功能，CD8+T 細胞為抑制/殺傷性T 細胞。CD4+T 細胞可協調B 細胞分化產生抗體，CD8+T細胞則抑制抗體合成、分泌及T 細胞增殖，CD8+T 細胞增多有利于腫瘤持續增長。CD4+、CD8+T 細胞在機體免疫過程中相互作用，二者在平衡狀態時才能維持機體免疫功能平衡與穩定。T 細胞亞群變化是評估惡性腫瘤患者和免疫相關性疾病患者免疫功能的有效方法［19］。NK 細胞對腫瘤細胞具有高度細胞毒性作用，能夠非特異直接殺傷腫瘤細胞，其殺傷腫瘤作用不需要特異性抗體參與，也不需要靶細胞上的MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類分子表達，是抗腫瘤免疫的第一道屏障［20］。NK 細胞數減少可導致機體免疫功能下降。本研究顯示，AA1 組外周血CD4+T、NK 細胞數顯著多于對照組，而CD8+T細胞數顯著少于對照組，提示AA1 組荷瘤小鼠免疫能力顯著提高。

JNK 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族成員［21］。JNK 家族包括 10 個由 3 個基因編碼的亞型。JNK1 和JNK2 存在于機體所有細胞和組織中，而JNK3 主要在心臟、大腦和睪丸中表達。研究表明，JNK磷酸化被激活在炎癥、凋亡、腫瘤壞死信號通路調控中發揮重要作用［21-22］。本研究顯示，AA1 組小鼠p-JNK 表達顯著高于對照組，說明該組荷瘤小鼠JNK信號通路被激活，腫瘤發生發展受到抑制。

綜上，TrxR 抑制劑AA1 可激活荷瘤小鼠抗腫瘤免疫，抑制胃癌發生進展，其機制可能與增強機體抗氧化能力、提高JNK 信號通路蛋白磷酸化表達有關，為深入探討其作用機制奠定基礎。