薯蕷皂苷元抑制宮頸癌免疫逃逸的作用及機制探討

郭紀芬 劉艷菊 楊筱（鄭州工業應用技術學院，鄭州451100）

宮頸癌是婦科常見腫瘤，發病率在全球女性中位居第四，死亡率在女性生殖系統腫瘤中位居第二，且發病呈年輕化［1］。目前宮頸癌治療采用手術治療配合化療技術，但患者預后差、5年生存率低、順鉑等化療藥物具有嚴重毒副作用且易產生耐藥性，導致療效較差［2］。近年腫瘤免疫療法逐漸受到重視，癌細胞可通過調節腫瘤免疫微環境逃避宿主免疫系統識別和攻擊，因此激活機體自身免疫系統清除腫瘤細胞是腫瘤免疫療法的關鍵，探索正向免疫刺激類藥物具有重要意義［3］。薯蕷皂苷元是廣泛存在于葫蘆巴屬和薯蕷屬植物中的天然甾體皂苷元，具有抗癌、抗炎、調節免疫力功效。研究表明，薯蕷皂苷元對小鼠T淋巴細胞具有調節作用［4］。薯蕷皂苷元能否影響宮頸癌微環境免疫逃逸的相關報道較少。目前發現，PD-1/PD-L1是癌細胞逃避免疫系統識別和攻擊的重要手段［5］。薯蕷皂苷元能否通過調節PD-1/PD-L1通路發揮抗癌功效鮮有報道。本文研究薯蕷皂苷元對宮頸癌微環境免疫逃逸的影響以及基于PD-1/PD-L1通路研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料4~6周齡SPF級BALB/c雌鼠50只，體重16~20 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司［SCXK（魯）20190003］；小鼠宮頸癌U14細胞系購自上海酶聯生物科技有限公司；順鉑注射液購自云南個舊生物藥業有限公司；薯蕷皂苷元購自成都德思特生物技術有限公司；小鼠IFN-γ和腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA試劑盒購自美國R&D公司；小鼠腫瘤浸潤組織淋巴細胞分離液試劑盒購自北京So?larbio公司；熒光定量預混染料購自北京TIANGEN公司；程序性死亡配體-1（PD-L1）、程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）和GAPDH兔單克隆抗體及二抗購自美國Abcam公司；鼠CD4 FITC、CD3PE-Cy5、CD8PE抗體和CD4+CD25+Foxp3+T細胞檢測試劑盒、PD-L1 PE、PD-1 APC抗體均購自美國Biolegend公司；BPN-240CRH細胞培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司；XT8207A酶標儀購自上海雄圖生物科技有限公司；CFX96 RT-qPCR儀購自美國伯樂公司；BSA224S電子天平購自德國賽多利斯公司；FACS CantoⅡ流式細胞儀購自美國BD公司；DYC-Mini4蛋白垂直電泳設備購自北京東方瑞利科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養小鼠宮頸癌U14細胞，37℃、5%CO2，待細胞80%融合時，棄培養基，加入PBS輕輕搖晃清洗，棄PBS，加入1 ml 0.25%胰酶消化，待細胞間隙增寬出現部分貼壁細胞脫落時，加入培養基終止消化。將貼壁細胞吹打至單個懸浮狀態，備用。

1.2.2 荷瘤小鼠建模分組與干預小鼠背部皮下接種小鼠宮頸癌U14細胞0.2 ml（1×107個/ml），接種7 d后小鼠背部出現米粒大小質硬結節即為宮頸癌荷瘤小鼠模型構建成功，將建模成功小鼠隨機分為5組：模型組、順鉑組和薯蕷皂苷元高、中、低劑量組。薯蕷皂苷元高、中、低劑量組分別灌胃給予薯蕷皂苷元溶液（160、80、40 mg/kg），順鉑組腹腔注射順鉑注射液（5 mg/kg），模型組灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，連續治療2周。

1.2.3 腫瘤體積變化檢測治療第1、5、10、14天，采用游標卡尺檢測腫瘤長徑（a），腫瘤短徑（b），計算腫瘤體積（V）=ab2/2。

1.2.4 腫瘤質量及抑瘤率檢測治療后取小鼠腫瘤組織，稱重，計算抑瘤率（%）=（1-實驗組小鼠瘤重/模型組小鼠瘤重）×100%。

1.2.5 ELISA檢測小鼠血清IFN-γ和TNF-α濃度取小鼠眼球靜脈血，室溫靜置2 h，取血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，以標準蛋白繪制標準曲線，計算小鼠血清中IFN-γ、TNF-α濃度。

1.2.6 腫瘤組織T細胞亞群水平及PD-L1、PD-1占比檢測采用三色法流式細胞儀檢測小鼠腫瘤組織中CD3+、CD4+、CD8+、CD25+Foxp3+Tregs及PD-L1、PD-1占比。無菌剝離小鼠腫瘤組織，剪碎，加入適量膠原酶37℃消化2 h，過200目細胞篩，收集濾液，4℃、1 000 g離心5 min，加入PBS重懸，加入淋巴細胞分離液，收集沉淀，PBS重懸即為淋巴細胞。向淋巴 細 胞 中 加 入CD4 FITC、CD3PE-Cy5、CD8PE、CD25 PE、PD-L1 PE、PD-1 APC抗體各20 μl與血液樣本混勻，空白管不加抗體，室溫孵育30 min，加入紅細胞裂解液，避光室溫孵育10 min，2 000 g離心5 min，棄上清，PBS清洗，2 000 g離心5 min，棄上清，PBS重懸，上機檢測。

1.2.7 RT-qPCR檢測小鼠腫瘤組織中PD-L1、脾臟組織中PD-1 mRNA表達取小鼠腫瘤組織、脾臟組織各50 mg，研磨勻漿，Trizol法提取組織RNA，反轉錄為cDNA。從NCBI基因庫中查詢PD-L1、PD-1 mRNA序 列 設 計 引 物。PD-L1 F：5'-TGAAAGC?CATAGCTAGGCAT-3'，R：5'-TAGCTCAGGATCATA?ACGATG-3'，121 bp；PD-1 F：5'-GTAGTAGCCATAG?ATGCGAAT-3'，R：5'-CGCTAAAGTAGACATTGTCG-3'，135 bp，GAPDH F：5'-TAGCTGATGAATCGGTGCAA-3'，R：5'-GTAGCTTAAGCATGACTAG-3'，114 bp。設置退火溫度為56℃，40個循環，2-ΔΔCt計算PD-L1、PD-1 mRNA相對表達。

1.2.8 Western blot檢測小鼠腫瘤組織中PD-L1、脾臟組織中PD-1蛋白表達取小鼠腫瘤組織、脾臟組織各50 mg，研磨勻漿，加入細胞裂解液提取組織總蛋白并進行蛋白凝膠電泳，轉膜，5%BSA封閉液室溫封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，PBST洗3次，更換二抗，室溫孵育2 h，PBST洗2次，顯色。根據GAPDH條帶灰度值分析目的蛋白相對表達。

1.3 統計學分析采用SPSS18.0軟件進行統計學分析，計量數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，重復樣本間比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠腫瘤體積如表1、圖1所示，5、10、14 d順鉑組、薯蕷皂苷元高、中、低劑量組小鼠腫瘤體積均小于模型組（P<0.05），薯蕷皂苷元高、中、低劑量組均大于順鉑組（P<0.05）。

圖1 小鼠腫瘤體積Fig.1 Tumor volume of mice

2.2 小鼠腫瘤質量及抑瘤率小鼠接種宮頸癌U14細胞7 d成瘤率達100%。順鉑組、薯蕷皂苷元高、中、低劑量組小鼠腫瘤質量均低于模型組（P<0.05），薯蕷皂苷元高、中、低劑量組均高于順鉑組（P<0.05）。抑瘤率結果顯示，順鉑組和薯蕷皂苷元高、中、低劑量組小鼠抑瘤率均高于模型組（P<0.05），薯蕷皂苷元高、中、低劑量組均低于順鉑組（P<0.05，表1）。

表1 治療后各組小鼠腫瘤體積（±s，n=10）Tab.1 Tumor volume of mice after treatment in each group（±s，n=10）

表1 治療后各組小鼠腫瘤體積（±s，n=10）Tab.1 Tumor volume of mice after treatment in each group（±s，n=10）

Note：Compared with Model，1）P<0.05；compared with Cisplatin，2）P<0.05；compared with 1 d，3）P<0.05；compared with 5 d，4）P<0.05；com?pared with 10 d，5）P<0.05.

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2.3 小鼠血清細胞因子檢測順鉑組和薯蕷皂苷元高、中、低劑量組小鼠血清IFN-γ、TNF-α水平均高于模型組（P<0.05），與順鉑組相比，薯蕷皂苷元高劑量組IFN-γ、TNF-α水平升高（P<0.05），薯蕷皂苷元低劑量組IFN-γ、TNF-α水平降低（P<0.05，表2）。

表2 小鼠血清IFN-γ和TNF-α水平（±s，n=10，pg/ml）Tab.2 Serum IFN-γ and TNF-α levels of mice（±s，n=10，pg/ml）

表2 小鼠血清IFN-γ和TNF-α水平（±s，n=10，pg/ml）Tab.2 Serum IFN-γ and TNF-α levels of mice（±s，n=10，pg/ml）

Note：Compared with Model，1）P<0.05；compared with Cisplatin，2）P<0.05.

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2.4 小鼠腫瘤組織T細胞亞群水平檢測薯蕷皂苷元高、中、低劑量組小鼠腫瘤組織CD3+、CD4+、CD8+細胞占比和CD4+/CD8+比值均高于模型組和順鉑組（P<0.05）。薯蕷皂苷元高、中、低劑量組CD4+CD25+Foxp3+Tregs、PD-L1+CD3+、PD-1+CD4+細胞占比均低于模型組和順鉑組（P<0.05，圖2、表3）。

表3 小鼠腫瘤組織CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+Foxp3+Tregs、PD-1+CD4+、PD-L1+CD3+占比（±s，n=10，%）Tab.3 Proportions of CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+，CD4+CD25+Foxp3+Tregs，PD-1+CD4+，PD-L1+CD3+in mouse tu?mor tissues（±s，n=10，%）

表3 小鼠腫瘤組織CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+Foxp3+Tregs、PD-1+CD4+、PD-L1+CD3+占比（±s，n=10，%）Tab.3 Proportions of CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+，CD4+CD25+Foxp3+Tregs，PD-1+CD4+，PD-L1+CD3+in mouse tu?mor tissues（±s，n=10，%）

Note：Compared with Model，1）P<0.05；compared with Cisplatin，2）P<0.05.

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圖2 小鼠腫瘤組織CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+Foxp3+Tregs、PD-L1+CD3+、PD-1+CD4+占比Fig.2 Proportions of CD3+，CD4+，CD8+，CD4+CD25+Foxp3+Tregs，PD-L1+CD3+，PD-1+CD4+in mouse tumor tissues

2.5 小鼠腫瘤組織中PD-L1、脾臟組織中PD-1mRNA表達薯蕷皂苷元高、中、低劑量組PD-L1和PD-1 mRNA表達均低于模型組和順鉑組（P<0.05，圖3）。

圖3 小鼠腫瘤組織PD-L1 mRNA、脾臟組織PD-1 mRNA表達Fig.3 Expressions of PD-L1 mRNA in mouse tumor tissues and PD-1 mRNA in mouse spleen tissues

2.6 小鼠腫瘤組織中PD-L1、脾臟組織中PD-1蛋白表達薯蕷皂苷元高、中、低劑量組PD-L1和PD-1蛋白表達均低于模型組和順鉑組（P<0.05，圖4、表4）。

表4 小鼠腫瘤組織PD-L1、脾臟組織PD-1蛋白相對表達（±s，n=10）Tab.4 Mouse tumor tissue PD-L1，spleen tissue PD-1 protein expressions（±s，n=10）

表4 小鼠腫瘤組織PD-L1、脾臟組織PD-1蛋白相對表達（±s，n=10）Tab.4 Mouse tumor tissue PD-L1，spleen tissue PD-1 protein expressions（±s，n=10）

Note：Compared with Model，1）P<0.05；compared with Cisplatin，2）P<0.05.

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圖4 小鼠腫瘤組織PD-L1、脾臟組織PD-1蛋白表達Fig.4 Mouse tumor tissue PD-L1，spleen tissue PD-1 protein expressions

3 討論

目前已知宮頸癌發生與人乳頭瘤病毒（HPV）持續感染密切相關，HPV與癌細胞可通過調節宿主免疫反應引發機體免疫抑制，逃避機體免疫監控，有利于癌細胞生長［6］。腫瘤微環境中免疫細胞凋亡、活性降低均是導致宮頸癌細胞免疫逃逸的主要機制［7］。因此減少腫瘤微環境中免疫細胞凋亡，提高免疫細胞活性是免疫療法治療宮頸癌的關鍵。薯蕷皂苷元是天然生物活性分子。研究表明，薯蕷皂苷元可提高腫瘤免疫微環境中巨噬細胞水平發揮抗癌作用［8］。薯蕷皂苷元能否通過抑制腫瘤細胞免疫逃避發揮抗癌作用的相關研究較少，因此本研究具有一定創新性。本研究顯示，薯蕷皂苷元治療后，與模型組相比，宮頸癌荷瘤小鼠腫瘤質量明顯減輕，抑瘤率升高，提示薯蕷皂苷元對宮頸癌具有治療效果。順鉑治療荷瘤小鼠腫瘤質量與血清細胞因子水平均低于模型組，但T細胞亞群、PD-1、PDL1水平均與模型組相當，原因可能為順鉑通過與DNA結合，抑制細胞有絲分裂，抗腫瘤作用顯著，但與免疫抑制及PD-1、PD-L1表達無相關性。

活化的T淋巴細胞可分泌IFN-γ和TNF-α發揮細胞毒殺傷作用，IFN-γ和TNF-α分泌水平高低與癌細胞殺傷程度呈正相關［9］。本研究顯示，薯蕷皂苷元治療后，小鼠血清IFN-γ、TNF-α水平升高，表明薯蕷皂苷元可影響IFN-γ、TNF-α水平，發揮抗癌作用。T淋巴細胞在抗腫瘤過程中發揮重要作用。CD3+細胞含量可反映成熟T淋巴細胞含量，T細胞又可分為CD4+、CD8+，CD4+/CD8+升高提示機體免疫功能提高［10］。本研究顯示，薯蕷皂苷元治療后，小鼠腫瘤組織CD3+、CD4+、CD8+比例、CD4+/CD8+與模型組相比均升高，表明薯蕷皂苷元可改善機體免疫功能。CD4+CD25+Foxp3+T細胞可在IL-10等細胞因子刺激下抑制其他T細胞活化，促進癌細胞免疫耐受和免疫逃逸［11］。研究表明，宮頸癌患者腫瘤組織CD4+CD25+Foxp3+T細胞占比異常增高［12］。本研究顯示，薯蕷皂苷元治療后，小鼠腫瘤組織CD4+CD2 5+Foxp3+T細胞占比降低，表明薯蕷皂苷元可改善腫瘤免疫微環境，抑制宮頸癌細胞免疫逃逸。

PD-1主要表達于活化的T、B細胞表面，可與其配體PD-L1相互作用參與負性協同刺激信號［13］。PD-L1可表達于多種免疫細胞表面，但癌細胞表面表達PD-L1是癌細胞逃逸機體免疫系統攻擊并能夠惡性增殖的主要因素之一［14］。癌細胞表面PD-L1可與T細胞表面PD-1特異性結合，可促進CD4+CD25+Foxp3+T細胞分化，發揮免疫逃逸作用［15］。研究表明，敲除CD8+T細胞PD-1基因可抑制癌細胞表面PD-L1結合能力，抑制腫瘤免疫逃逸，并減少IFN-γ、TNF-α分泌［16］。此外，已證實宮頸癌患者腫瘤組織中可檢測出PD-L1、PD-1和CD8+表達增高，采用PD-1/PD-L1抗體藥物治療則表現出抗癌療效［17-18］。本研究顯示，薯蕷皂苷元治療后，小鼠腫瘤組織PD-1+CD4+、PD-L1+CD3+細胞占比、腫瘤PD-L1和脾臟PD-1水平均低于模型組，由此推測薯蕷皂苷元可抑制癌細胞免疫逃逸，其機制可能與抑制PD-L1和PD-1 mRNA和蛋白表達有關。

綜上所述，薯蕷皂苷元可抑制宮頸癌荷瘤小鼠瘤體生長，調節細胞因子水平，改善機體免疫功能，抑制癌細胞免疫逃逸，其機制可能與抑制PD-L1和PD-1 mRNA和蛋白表達有關。癌細胞免疫逃逸機制較為復雜，本研究僅從PD-L1和PD-1調控角度探索薯蕷皂苷元的作用機制，薯蕷皂苷元是否影響其他通路有待進一步研究。