GⅡ.17型諾如病毒人源中和性單鏈抗體制備及生物特性鑒定①

王璐 侯玉珍 曾志云 謝東杰 邱夢絲 張緒富戴迎春

（南方醫科大學公共衛生學院流行病學系，廣州510515）

諾如病毒（norovirus，NoV）是引發全球各年齡段人群急性胃腸炎（acute gastroenteritis，AGE）暴發流行及散發的主要病原體，占全球AGE發病的近20%［1］。NoV的低感染劑量及傳播途徑多樣化，在醫院、養老院、學校、托兒中心及餐館等半封閉環境中迅速傳播［2-4］。全球范圍內，NoV感染每年可導致約6.99億病例和22萬人死亡，醫療費用達40億美元以上，因喪失勞動力產生的間接社會費用超過600億美元［1，5］。我國NoV發病率為80萬例/年，年均發病率為6.0/100人年，5歲以下兒童年均發病率約為15.6/100人年［6］。因此，NoV暴發流行及散發是我國及世界范圍內的重要公共衛生問題。

NoV屬杯狀病毒科，是單股正鏈小RNA病毒，直徑約27~38 nm，基因組全長約7.4~7.7 kb，可識別人類組織血型抗原（histo-blooding group antigen，HBGA）作為受體或病毒附著因子，HBGA是研究NoV易感性和致病性的重要因素［7-10］?；赩P1氨基酸序列的多樣性，可將其分為GⅠ~GⅩ共10個基因組，共49個基因型［11］。GⅠ、GⅡ和GⅣ可感染人類，其中GⅡ.4 NoV是1996年以來暴發流行及散發最主要基因型，占所有NoV相關胃腸炎暴發的70%~80%［6，12］。2014年以來，中國、日本等亞洲國家均報道了由GⅡ.P7~GⅡ.17新變異株引發的NoV相關胃腸炎暴發［13-15］。2014~2015年，這一變異株在NoV暴發中占76.9%，取代GⅡ.4/2012 Sydney株成為我國2014~2015年和2015~2016年NoV流行的主要流行株［16］。

目前，NoV疫苗和特異性抗體藥物研究主要集中于GⅡ.4，本團隊前期研究表明，GⅡ.4預存抗體對與GⅡ.17感染無明顯交叉保護作用，因此建議將GⅡ.17納入NoV候選疫苗研制范疇，開展其中和抗體及抗原表位研究［17］。本研究基于一起GⅡ.17 NoV感染引發的急性胃腸炎暴發，采集患者恢復期外周血，采用噬菌體展示技術構建NoV噬菌體抗體庫，篩選特異性GⅡ.17 NoV單鏈抗體，并進行原核系統表達，得到中和性單鏈抗體，為NoV臨床防治及相關疫苗研制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、限制性內切酶NotⅠ/SfiⅠ/BamHⅠ、GeneJET Gel Extraction Kit、GeneJET Plasmid Miniprep Kit、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase購自Thermo Fisher Scientific；High Pure Viral RNA Kit購自羅氏公司；NoV熒光定量檢測試劑盒購自上海之江生物科技有限公司；Ficoll-PaqueTMPLUS Media淋巴細胞分離液、HRP-鼠抗M13單克隆抗體和凝血酶購自GE公司；T4連接酶 和DNA Marker購 自TaKaRa公司；免疫管購自NUNC公司；96孔酶標板購自Corn?ing公 司；2×Phanta Max高 保 真 聚 合 酶 和ClonEx?press?ⅡOne Step Cloning Kit購自諾唯贊公司；TMB、大腸桿菌E.coliTG1購自碧云天公司；大腸桿菌E.coli TOP10和BL21購自天根生物技術有限公司；噬菌粒載體pCANTAB-5E購自Amersham Bio?sciences公 司；pGEX-4T-1質 粒、輔 助 噬 菌 體M13KO7、GⅡ.17/GⅡ.4/GI.3 NoV P顆 粒、鼠 抗GⅡ.17/GⅡ.4/GⅠ.3 NoV血清和分泌型B型唾液為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及病例定義2017年12月25日廣州市某部隊暴發一起以嘔吐、腹瀉等為主要癥狀的急性胃腸炎［18］。采集患者肛拭子或糞便樣本18份，2018年1月16日（暴發后3周）采集患者恢復期外周血13份，患者知情同意。根據《NoV感染暴發調查和預防控制技術指南（2015版）》，臨床診斷病例為2017年12月25日以來，該部隊所有官兵出現腹瀉（≥3次/24 h，伴有大便性狀改變）或嘔吐（≥3次/24 h）之一者；確診病例定義為糞便或肛拭子標本經NoV核酸檢測呈陽性的臨床診斷病例［19］。

1.2.2 糞便混懸液制備與總RNA提取采用PBS將糞便配制為10%~20%懸液，劇烈振蕩1 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，-80℃保存。按照High Pure Viral RNA Kit說明書，從肛拭子或糞便樣本中提取病毒核酸，得到的總RNA用于RTRCR檢測或-80℃保存。實驗均在二級生物安全柜中進行。

1.2.3 RT-PCR和實時熒光RT-PCR按照Rever?tAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書對總RNA進行RT-PCR檢測。根據NoV熒光定量檢測試劑盒說明書檢測NoV GⅠ、GⅡ型。判斷標準：Ct≤30為陽性；30

1.2.4 NoV基因序列擴增、純化及序列分析按照Phusion High-Fidelity DNA Polymerase說明書，擴增NoV衣殼蛋白基因區N/S端基因序列，判斷NoV基因型；擴增P區域基因序列，構建進化樹。根據GeneJET Gel Extraction Kit說明書，對PCR產物進行純化，并將產物送華大基因公司進行測序。采用DNAStar中的MegAlign分析核苷酸序列同源性，Mega 4.0軟件分析基因序列，鄰接法（neighbor-join?ing，NJ）構建系統進化樹，自展法（bootstrap）進行可信度檢測，重復次數設為1 000。

1.2.5 患者恢復期外周血中總RNA提取按照密度梯度離心法，采用Ficoll-PaqueTMPLUS Media淋巴細胞分離液從NoV患者恢復期外周血中分離PBMC和血漿，Trizol法提取PBMC總RNA，并進行RT-PCR檢測，采用隨機引物合成cDNA第一鏈。

1.2.6 pCANTAB-5E-scFv重組質粒構建參考文獻［20-21］，設計合成擴增人抗體基因引物。以cD?NA第一鏈為模板，分別采用抗體重輕鏈的混合正反向引物擴增抗體重輕鏈基因（VH和VL）；以等量VH和VL為模板，重疊PCR將兩者隨機拼接成scFv；采用限制性內切酶SfiⅠ和NotⅠ分別將pCANTAB-5E和scFv雙酶切，回收雙酶切片段；采用用T4連接酶將兩者純化產物16℃連接過夜，所得產物即為重組質粒pCANTAB-5E-scFv。

1.2.7 人源GⅡ.17型NoV噬菌體單鏈抗體庫構建將重組質粒電轉化至感受態細胞E.coli TG1中，37℃、180 r/min振蕩培養1 h，取少量菌液梯度稀釋，鋪SOB-AG固體培養基30℃培養過夜；次日隨機挑取單克隆抗體進行菌落PCR，選取陽性克隆測序，鑒定抗體庫重組率和多樣性，測定抗體庫初級庫容；剩余菌液加入輔助噬菌體M13KO7和氨芐青霉素（100 mg/ml），37℃孵育30 min，37℃、180 r/min振蕩培養1 h；1 000 g離心10 min，棄上清，采用2×YT-AK培養基混勻菌體，37℃、250 r/min振蕩培養12~16 h；次日4℃、1 000 g離心15 min，收集上清，PEG/NaCl沉淀重組噬菌體顆粒，混勻，冰上孵育30 min；4℃、10 000 g離心30 min，棄上清，1%BSA重懸沉淀；4℃、10 000 g離心5 min，收集上清，即得到人源抗NoV噬菌體單鏈抗體庫。取少量菌液梯度稀釋，加入對數期TG1，室溫孵育15 min，鋪板，過夜培養，數克隆數，計算抗體滴度。實驗均在二級生物安全柜中進行。

1.2.8 噬菌體抗體庫篩選以GⅡ.17 NoV P顆粒（5μg/ml）為固相抗原，包被免疫管，4℃孵育過夜，PBS洗2遍，5%脫脂奶封閉，37℃孵育2 h，PBS洗2遍，加入1 ml噬菌體抗體庫，37℃孵育2 h，0.05%PBST洗9~15遍，加入對數期E.coli TG1直接感染，37℃孵育15 min，移至培養瓶，補加2×YT-A培養基；向免疫管內加入0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸洗脫液（pH=2.2）37℃孵育10 min，顛倒數次，加入2 mol/L Tris中和液（pH=8.8）快速混勻，再次加入對數期TG1，37℃孵育15 min；將免疫管中菌液轉移至上述培養瓶，混勻，取少量菌液鋪氨芐抗性瓊脂板，隔日計算產出量，37℃、220 r/min振蕩培養1 h，補加2×YT-A培養基，培養至對數生長期，加入輔助噬菌體M13KO7，并加入卡那霉素（50 mg/ml），30℃、220 r/min振蕩培養過夜；次日4℃、8 000 r/min離心15 min，收集上清，加入PEG/NaCl充分混勻，冰浴30 min；4℃、8 000 r/min離心30 min，棄上清，1% BSA重懸沉淀；4℃、10 000 g離心5 min，收集上清。取少量上清梯度稀釋，鋪氨芐抗性瓊脂板，隔日計算投入量，并進行下一輪篩選，“吸附-洗滌-洗脫-感染-拯救”共4輪，最終富集與GⅡ.17 P顆粒特異性結合的噬菌體單鏈抗體。實驗均在二級生物安全柜中進行。

1.2.9 Phage-ELISA鑒定及DNA序列分析第4輪洗脫后挑取瓊脂板上單克隆，加入2×YT-A培養基，37℃、200 r/min振蕩培養8 h，補加輔助噬菌體M13KO7，30℃、200 r/min振蕩培養過夜；次日室溫1 000 r/min離心5 min，收集噬菌體上清。實驗均在二級生物安全柜中進行。將GⅡ.17 NoV P顆粒（0.1μg/ml）、輪狀病毒VP8*（對照抗原，0.1μg/ml）、PBS（空白對照）包被于96孔酶標板，以獲得的噬菌體上清為一抗，同時以無噬菌體上清的培養基為陰性對照，HRP-antiM13抗體為二抗，TMB顯色，測定各孔OD450，選取OD450值較高的陽性噬菌體克隆，送華大基因公司測序，DNA Star軟件分析測序結果。

1.2.10 原核表達載體pGEX-scFv構建根據陽性克隆測序結果，挑取序列正確的克隆，設計scFv原核表達引物，在上下游引物中均引入載體pGEX-4T-1的兩末端同源序列，分別引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位點。以陽性克隆的菌液為模板，采用對應引物分別擴增scFv片段，根據ClonExpress?ⅡOne Step Cloning Kit說明書，將scFv片段重組克隆至線性化載體pGEX-4T-1，并將同源重組產物轉化至感受態細胞E.coli T0P10，取菌液鋪氨芐抗性瓊脂板，37℃培養過夜。次日挑取單克隆進行菌液PCR，將陽性克隆送測序，并按照GeneJET Plasmid Miniprep Kit說明書提取重組質粒，即為重組原核表達載體

pGEX-scFv。

1.2.11 scFv原核表達及純化將pGEX-scFv質粒轉至感受態細胞E.coliBL21，取菌液鋪氨芐抗性瓊脂板，37℃培養過夜。次日挑取單克隆，37℃、200 r/min振蕩培養過夜；按1∶100轉接至LB培養基，37℃振蕩培養至細菌對數期，加入1 mmol/L IPTG，22℃、220 r/min振蕩過夜誘導表達。4℃、5 000 r/min離心12 min，收集菌體，PBS充分重懸菌體，冰浴中對其進行超聲破碎；4℃、12 000 r/min離心75 min，收集上清，采用GST-resin親和層析柱進行分離純化，加入凝血酶，22℃酶切過夜，次日收集濾液，即為scFv可溶性抗體。

1.2.12 scFv抗體特異性鑒定將純化后的scFv抗體稀釋至終濃度為1μg/ml，包被于96孔酶標板，以GST蛋白為陰性對照，PBS為空白對照，4℃孵育過夜，封閉，加入GⅡ.17 NoV P顆粒（0.02μg/ml），37℃孵育1 h；以鼠抗GⅡ.17血清為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗，TMB顯色，測定各孔OD450。

1.2.13 scFv抗體中和能力檢測采用HBGA受體結合實驗確定所用GⅡ.17 NoV P顆粒濃度，采用經預試驗證實結合力強和穩定性高的B型抗原作為HBGA受體，與梯度稀釋的GⅡ.17 NoV P顆粒結合，使其OD450為0.7~1.3。將HBGA表型明確的分泌型B型唾液標本稀釋至終濃度為1∶1 000，包被于96孔酶標板，4℃孵育過夜；將已確定所用濃度的GⅡ.17 NoV P顆粒與4倍梯度稀釋的scFv（稀釋濃度為40、10、2.5 μg/ml）的混合液37℃孵育1 h，陽性對照采用未加scFv的P顆粒，陰性對照采用確定無阻斷能力的血漿和P顆粒的混合液，空白對照采用1%脫脂奶粉-PBS代替scFv和P顆粒的混合液，加入酶標板，并以鼠抗GⅡ.17血清為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗，TMB顯色，測定各孔OD450。阻斷率（%）=（陽性對照OD450-實驗組各孔OD450）/陽性對照OD450×100%。

1.2.14 scFv抗體與GⅡ.4/GⅠ.3 NoV P顆粒交叉反應選取常見流行株GⅠ.3和GⅡ.4分別作為GⅠ和GⅡ型代表株，與單鏈抗體進行交叉反應。具體操作同1.2.12。

2 結果

2.1 暴發調查及NoV序列進化分析實時熒光RT-PCR檢測結果顯示，18份糞便或肛拭子樣本中15份為GⅡNoV核酸陽性，RT-PCR擴增NoV衣殼蛋白N/S區序列并測序，經GenBank BLAST比對分析確定該急性胃腸炎暴發由GⅡ.17型NoV感染引起。GJ10、GJ11和GJ13株核苷酸序列同源性達99.7%~100%，并從GenBank中選取NoV VP1基因序列，構建系統進化樹（圖1）。

圖1 GⅡ.17型NoV VP1部分基因進化樹Fig.1 Phylogenetic analysis based on partial VP1 gene sequence of GⅡ.17 NoV

2.2 VH和VL基因擴增以PBMC中獲得的cDNA第一鏈為模板，PCR擴增抗體重輕鏈可變區基因VH和VL（Vκ和Vλ），片段大小為300~500 bp，凝膠電泳結果見圖2。

圖2 VH和VL基因PCR擴增產物Fig.2 PCR amplification results of VH and VL

2.3 噬菌體抗體庫構建及鑒定采用Overlap PCR將VH和VL拼接為約750 bp的scFv片段（圖3A），將

其克隆至pCANTAB-5E，電轉獲得初級噬菌體抗體庫，挑取單菌落進行PCR檢測并測序，結果顯示，各序列彼此不重復，說明該抗體庫重組率和多樣性均較好（圖3B）。根據板上細菌生長情況，計算初級噬菌體抗體庫庫容約為2.4×107CFU/ml。

圖3 scFv片段、抗體庫菌落PCR產物Fig.3 PCR products of scFv and clones from antibody library

2.4 噬菌體抗體庫富集以GⅡ.17 NoV P顆粒為固相抗原，對噬菌體抗體庫進行4輪富集，噬菌體產出率從第1輪的2.8×10-7提升至第4輪的2.9×10-5，說明抗GⅡ.17 NoV特異性噬菌體單鏈抗體得到有效富集（表1）。

表1 噬菌體抗體庫4輪篩選結果Tab.1 Results of 4 rounds of phage antibody library screening

2.5 Phage-ELISA鑒定及序列分析隨機挑取第4輪篩選出的單克隆抗體，加入輔助噬菌體M13KO7拯救，包被GⅡ.17 NoV P顆粒，取噬菌體上清進行Phage-ELISA，將陽性菌液進行測序分析，最終得到11株序列不同且正確的單鏈抗體基因scFv（圖4）。

圖4 噬菌體陽性克隆Phage-ELISA鑒定Fig.4 Phage-ELISA identification of positive clones of phage

2.6 篩選后scFv DNA序列分析選取測序結果中1條核酸序列進行翻譯，酶切位點SfiⅠ和NotⅠ間的scFv基因片段全長753 bp，其中VH片段為366 bp，編碼122個氨基酸，VL為342 bp，編碼113個氨基酸，連接肽為1條15個氨基酸的多肽片段（圖5）。

圖5 scFv測序及翻譯結果分析Fig.5 Sequencing and translation analysis of scFv

2.7 全人源scFv表達以序列正確且翻譯無誤的陽性菌液為模板，PCR擴增scFv片段，將產物與載體pGEX-4T-1連接轉化，構建原核表達載體pGEXscFv，并于感受態細胞E.coliBL21中表達，純化所得抗體經SDS-PAGE電泳鑒定，可見9個約27 kD的目的蛋白（圖6），與scFv大小相符，成功獲得9株全人源單鏈抗體scFv。

圖6 全人源scFv SDS-PAGE結果Fig.6 SDS-PAGE results of human scFv

2.8 scFv特異性鑒定采用ELISA鑒定scFv特異性，結果顯示，9株抗體可與GⅡ.17 NoV P顆粒結合，均具有良好反應性（圖7）。

圖7 scFv特異性鑒定Fig.7 Identification of scFv specificity

2.9 scFv中和能力鑒定采用體外HBGA受體阻斷實驗確定9株scFv中和能力，即阻斷GⅡ.17 NoV P顆粒與HBGA受體結合能力，結果顯示，9株scFv隨濃度增加，阻斷率逐漸升高，40 μg/ml時阻斷率均>50%，其中6A09中和能力最強，40μg/ml時阻斷率達76.0%（圖8）。

圖8 scFv阻斷GⅡ.17 P顆粒與HBGA結合的能力Fig.8 Ability of scFv to block GⅡ.17 P particle binding to HBGA receptor

2.10 scFv與GⅡ.4/GⅠ.3 NoV P顆粒的交叉反應

ELISA鑒定scFv與GⅡ.4/GⅠ.3 NoV P顆粒的交叉識別能力，結果顯示，9株抗體與GⅡ.4/GⅠ.3 NoV P顆粒均具有良好的交叉反應（圖9）。

圖9 scFv抗體與GⅡ.4/GⅠ.3 P顆粒的交叉反應Fig.9 Cross reaction between scFv and GⅡ.4/GⅠ.3 P particles

3 討論

NoV是全球范圍內引起各年齡AGE暴發、散發及流行的主要病原體，由于NoV流行株的抗原多樣性、變異進化，且缺乏成熟的細胞培養系統及小動物感染模型，其疫苗和特異性抗病毒藥物研究進展緩慢，過去30年，GⅡ.4 NoV一直是全球范圍內的優勢流行株，因此，現階段NoV疫苗開發及研制主要集中于GⅡ.4，5種亞單位候選疫苗已進入臨床和臨床前研究階段［22］。本團隊前期研究表明，GⅡ.4抗體免疫對與GⅡ.17感染無交叉保護作用［17］，因此開展GⅡ.17 NoV特異性中和抗體及疫苗研制具有重要意義。

傳統單克隆抗體制備主要采用雜交瘤技術，但獲得的鼠源性單抗用于人類具有較強的免疫原性，易誘發人抗鼠抗體（human anti-mouse antibody，HA?MA）反應，導致其在體內半衰期較短，無法有效激活人體生物效應［23-25］。與前者相比，全人源抗體具有親和力強、特異性高等特點，且無種屬異源性，是重要的治療性抗體藥物。噬菌體抗體庫技術是目前最成熟、應用最廣泛的人源抗體制備技術之一，將抗體基因編碼肽段和噬菌體外殼蛋白融合并展示于噬菌體表面，再對抗體庫進行多輪“吸附-洗脫-擴增”，可篩選出大量特異性抗體基因，具有高效、快捷、經濟等優勢，所得抗體庫易于進行高通量篩選。與IgG和Fab相比，scFv具有可更好在原核系統中表達、耐受性好、免疫原性低、安全性和有效性更高等優點。中和性抗體也在抗病毒免疫保護中起重要作用［26-28］。目前采用該技術已成功制備多種FDA批準使用的人源單克隆抗體，如Ranibizumab用于濕性老年性黃斑變性治療，Raxibacumab與抗菌藥物聯合用于吸入性炭疽的預防治療等［28］。

本研究基于一起GⅡ.17 NoV引起的急性胃腸炎暴發，采集患者恢復期外周血，這一階段，體內可產生大量記憶性B細胞，前期實驗發現患者血漿中具有較高水平的中和抗體，為制備中和性scFv庫提供保障；采用噬菌體展示技術獲得庫容約為2.4×107CFU/ml的全人源噬菌體抗體庫，篩選得到11株與GⅡ.17 NoV特異性結合的scFv；在原核系統中進行表達純化，得到9株高純度scFv抗體；采用體外HBGA受體阻斷實驗對其中和能力進行鑒定，最終獲得7株可明顯阻斷GⅡ.17與HBGA受體結合的scFv。其 中，Phage-ELISA結 果 顯 示，1A06株 與GⅡ.17 P顆粒結合能力最強，與scFv特異性鑒定中的強弱結果不一致，原因可能為前者所用一抗為噬菌體抗體，而后續實驗采用的是經原核系統表達純化的scFv，噬菌體抗體和純化后的抗體結構和性質可能有差異，而噬菌體自身外殼蛋白也可能影響scFv屬性，從而導致Phage-ELISA與后續實驗結果差異。該9株scFv與GⅡ.4和GⅠ.3 P顆粒交叉反應結果顯示，GⅡ.17 NoV scFv對GⅡ.4/GⅠ.3有較好的交叉反應，說明該抗體可能對NoV其他亞型存在交叉識別現象。

本研究獲得的具有中和能力的全人源抗GⅡ.17 NoV scFv具有高親和力和高特異性，有望成為抗體候選藥物，同時可用于后續中和表位鑒定，對NoV新型表位疫苗設計和抗體藥物研發具有重要意義。