TNF-α與系統(tǒng)性硬化病關(guān)系的研究進(jìn)展①

陶志清 趙鋮（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，南寧530021）

系統(tǒng)性硬化病（systemic sclerosis，SSc）是一種多系統(tǒng)結(jié)締組織疾病，其主要病理特征包括異常免疫激活、血管病變和組織纖維化，病因不明，較多認(rèn)為是血管病變和免疫系統(tǒng)的活化與炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生導(dǎo)致不受控制的成纖維細(xì)胞活化［1］。SSc的典型表現(xiàn)是皮膚緊繃和雷諾現(xiàn)象，通常開始于四肢，尤其是手指和足趾的皮膚。根據(jù)皮膚受累程度，SSc可分為兩大類：局限性全身硬化（lcSSc）和彌漫性全身硬化（dcSSc）。在dcSSc中，纖維化遍及皮膚和內(nèi)臟器官，而在lcSSc中，纖維化主要局限于手、手臂和面部。鑒于臨床癥狀和體征的異質(zhì)性，美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟于2013年制定了新的分類標(biāo)準(zhǔn)［2］。SSc相關(guān)的肺間質(zhì)疾病和肺動脈高壓的發(fā)展，是SSc中最常見的致殘和死亡原因［3］。TNF-α是一種多效細(xì)胞因子，參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)炎癥、抑制病毒復(fù)制和纖維化過程中興奮性白細(xì)胞介素的信號傳導(dǎo)。TNF-α在感染的初始宿主反應(yīng)和各種免疫介導(dǎo)的疾病發(fā)病機制中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在SSc患者血清中TNF-α水平升高，并有利于肺纖維化和肺動脈高壓的發(fā)展［4］。TNF-α通過調(diào)節(jié)纖維增生功能參與炎癥、纖維化、血管內(nèi)皮的激活以及免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。因此，它被認(rèn)為是SSc進(jìn)展的主要因素。

1 系統(tǒng)性硬化病發(fā)病機制

1.1 遺傳相關(guān)因素流行病學(xué)研究表明，SSc患者的一級親屬患SSc的風(fēng)險顯著增加：風(fēng)險為1.6%，而在普通人群中，患SSc的風(fēng)險為0.026%［5］。在這些集群中，親屬往往具有相同的疾病相關(guān)的自身抗體。這些數(shù)據(jù)表明SSc在親屬關(guān)系的人群中的遺傳易感性［5-6］。

1.2 內(nèi)分泌相關(guān)因素有研究表明，內(nèi)分泌可能參與了疾病狀態(tài)的啟動或傳播。女性性激素雌二醇增加了某些重要的SSc介質(zhì)（干擾素-γ、白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子）的促纖維化作用［7］。

1.3 感染相關(guān)因素關(guān)于硬皮病感染觸發(fā)的一個假說是關(guān)于潛伏性巨細(xì)胞病毒（CMV）感染的作用，在SSc中發(fā)現(xiàn)的潛在致病的自體抗原與巨細(xì)胞病毒（CMV）上的UL94蛋白結(jié)合，也與人內(nèi)皮細(xì)胞表面結(jié)合，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡（內(nèi)皮細(xì)胞損傷通常被認(rèn)為是SSc疾病過程中的早期事件）［8］。

1.4 腫瘤相關(guān)因素研究發(fā)現(xiàn)，硬皮病和ARA抗體患者的惡性腫瘤發(fā)生率較高，且在這一亞群中，結(jié)締組織病的發(fā)生與癌癥的診斷有密切的時間關(guān)系［9-10］。JOSEPH等［11］從這一亞組患者提取的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了RNA聚合酶Ⅲ多肽A基因（POL3RA）的改變，但在來自相同患者的對照組織或來自其他硬皮病亞組患者的腫瘤組織中沒有發(fā)現(xiàn)。

1.5 免疫相關(guān)因素在細(xì)胞黏附分子活性增加的情況下，SSc中CD4陽性T細(xì)胞的遷移和活化增強［12］，這種細(xì)胞類型主要見于皮膚和肺組織的淋巴細(xì)胞浸潤［13-14］。輔助性T細(xì)胞17（Th17）亞群的分化可能是SSc的一個重要過程，這些細(xì)胞具有促纖維化作用［15］。

1.6 環(huán)境相關(guān)因素職業(yè)和工業(yè)接觸氯乙烯、二氧化硅粉塵和有機溶劑被認(rèn)為是導(dǎo)致SSc的原因［16］。

2 TNF-α信號通路概述

2.1 TNF-α形成和家族TNF按其結(jié)構(gòu)分為兩型：TNF-α和TNF-β，其中TNF-α的生物學(xué)活性占TNF總活性的70%~95%。TNF-α是一種多效細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，也由淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。TNF-α以可溶性和膜結(jié)合形式存在。可溶性血漿形式的TNF-α被金屬蛋白酶從膜形式上切割下來，該金屬蛋白酶稱為TNF-α轉(zhuǎn)化酶（TNF-α-converting enzyme，TACE），屬于ADAMs家族。可溶性TNF-α是分子量為17 kD的蛋白質(zhì)，由157個氨基酸組成，形成受體激活的同源三聚體。目前已有19個TNF家族成員和29個受體被鑒定［17］。

2.2 TNF-α受體1和TNF-α受體2 TNF-α的活性是通過其兩種受體TNF-R1（p55）和TNF-R2（p75）介導(dǎo)的，它們的信號傳導(dǎo)活性不同。TNF-R1通常是促凋亡的，而TNF-R2通常是抗細(xì)胞凋亡的［18］。TNF-R1和TNF-R2具有相似的細(xì)胞外TNF結(jié)合結(jié)構(gòu)，其特征在于四個重復(fù)的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，但具有不同的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域［19］。TNF-R1和TNF-R2之間的主要結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致其生物活性的差異，其主要原因在于TNF-R2缺乏細(xì)胞內(nèi)死亡域。在許多系統(tǒng)中，TNF-α通過激活TNF-R1促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過TNF-R2引起促存活信號傳導(dǎo)［20］。在結(jié)合TNF-α后，TNF-R1募集銜接蛋白TNF-R1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD）及其下游半胱天冬酶（即胱天蛋白酶8），引起細(xì)胞凋亡［21］，相反，當(dāng)TNF-α激活TNF-R2時，TNF受體相關(guān)因子（TRAF2）募集，從而刺激具有抗凋亡特性的核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB），與可溶性TNF-α相比，已知TNF-R2對膜結(jié)合TNF-α具有更高的親和力。TNF-R2的激活與Treg細(xì)胞的擴(kuò)增和免疫抑制有關(guān)［20］。有研究推測TNFR2參與了纖維形成，TNFR2的過量表達(dá)，隨后蛋白酶脫落，與滅活的可溶性TNF相結(jié)合而產(chǎn)生抗炎作用。

3 TNF-α的生理功能

TNF-α具有多效性，TNF-α已被證實可調(diào)節(jié)多種炎癥和自身免疫過程。低水平的TNF-α可調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)起到抗感染的作用，高水平的TNF-α又會誘導(dǎo)其他炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等的分泌，促進(jìn)體內(nèi)炎癥反應(yīng)［22-23］。TNF-α可通過促進(jìn)T細(xì)胞增殖、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用殺傷腫瘤，也可通過募集免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素和環(huán)氧合酶、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等途徑促進(jìn)細(xì)胞變性與炎癥進(jìn)展［24］。

4 TNF-α在系統(tǒng)性硬化病中的作用及異常表現(xiàn)

4.1 TNF-α促炎作用TNF-α是最重要的促炎細(xì)胞因子，它直接參與細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)。TNF-α在SSc患者皮膚顆粒層的表達(dá)增加，特別是在SSc早期，提示TNF-α可能在SSc早期炎癥階段起作用，研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性硬化真皮成纖維細(xì)胞對TNF-α反應(yīng)過度，細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）的表達(dá)在TNF-α刺激作用下增加到更大程度。TNF-α刺激活性氧（ROS）和活性氮物質(zhì)（RNS）的釋放，消耗細(xì)胞谷胱甘肽，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和凋亡，并促進(jìn)肺纖維化。TNF-α通過與受體相結(jié)合進(jìn)而激活其下游的NFκB信號通路，促進(jìn)了一系列的炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IFN-γ等的分泌，放大了炎癥反應(yīng)。TNF-α通過激活NF-κB信號通路促進(jìn)肺間充質(zhì)干細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞分化，這些結(jié)果表明，富含TNF-α的促炎微環(huán)境可能通過激活NF-κB信號傳導(dǎo)在間質(zhì)炎癥和纖維化的發(fā)展中起重要作用［25］。

4.2 TNF-α促纖維化作用細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞功能（如增殖、遷移和基質(zhì)合成）方面發(fā)揮重要作用，而這些介質(zhì)的平衡可能在調(diào)節(jié)任何纖維化疾病、瘢痕形成和進(jìn)展方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，體外實驗發(fā)現(xiàn)TNF-α可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖。TNF-α在膠原蛋白和膠原酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用。它導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖增加、膠原合成增加、膠原酶產(chǎn)量增加和蛋白酶產(chǎn)量增加等［26］。PIGUET等［27］發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)注射TNF-α刺激成纖維細(xì)胞和膠原蛋白的積累。HU等［28］發(fā)現(xiàn)TNF-α在體外促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長活性。

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是SSc纖維化病變的關(guān)鍵因子，參與細(xì)胞的生長、凋亡、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。TNF-α是一種具有纖維性質(zhì)的細(xì)胞因子，能刺激膠原蛋白合成，誘導(dǎo)TGF-β并促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖［26］。TNF-α可加速上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）并上調(diào)原代小鼠肺成纖維細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)。TNF-α上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，激活NF-κB，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、分化，最終導(dǎo)致肺纖維化［29］。

4.3 TNF-α促進(jìn)血管內(nèi)皮的激活TNF-α可能在SSc發(fā)病早期即血管改變中發(fā)揮重要作用。由于缺血再灌注是肺內(nèi)皮損傷的主要決定因素，因此，TNF-α可能通過增強血小板活化因子誘導(dǎo)的肺循環(huán)血管收縮在SSc中發(fā)揮重要作用。TNF-α血清水平的升高可能促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是慢性免疫介導(dǎo)性和變應(yīng)性疾病炎癥的重要介質(zhì)，是一種改變微血管網(wǎng)絡(luò)的促血管生成因子，促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙和肺動脈高壓的發(fā)生和進(jìn)展［30-31］。此外，TNF-α增加了低密度脂蛋白受體1的基因表達(dá)，這種受體可以支持革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌對血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的黏附，表明其在炎癥和血管損傷中的作用。TNF-α還誘導(dǎo)血管黏附分子1（VCAM-1）的基因表達(dá)，VCAM-1在損傷和平滑肌細(xì)胞增殖的情況下，在單核細(xì)胞黏附和新內(nèi)膜形成中起基本作用。TNF-α參與血管內(nèi)皮的活化，通過調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的功能來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和結(jié)締組織的代謝，在系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機制中起重要作用［30］。

4.4 TNF-α免疫調(diào)節(jié)作用在SSc早期，T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素和TNF-α。TNF-α是一種多效細(xì)胞因子，主要以其促炎特性而為人所知，然而TNF-α也具有免疫抑制反饋作用［32］。HUGLE等［33］首次采用多色流式細(xì)胞術(shù)研究了SSc患者真皮層不同白細(xì)胞亞群的TNFR的表達(dá)水平，結(jié)果表明TNFR1、TNFR2在彌漫性SSc患者真皮T淋巴細(xì)胞表達(dá)中上調(diào)，TNFR2的表達(dá)與皮膚增厚有關(guān)。用CD3/CD28抗體活化后，SSc患者外周血淋巴細(xì)胞較健康淋巴細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-6、可溶性IL-6受體（sIL-6R）和IL-13，TNFR1選擇性配體和可溶性TNF的共刺激進(jìn)一步增加IL-6的表達(dá)，而TNFR2的刺激導(dǎo)致更高的sIL-6R的釋放。這說明膜結(jié)合TNF能有效激活TNFR1和TNFR2，對IL-6和sIL-6R表達(dá)有較強的影響，可能誘導(dǎo)IL-6信號傳導(dǎo)［33］。肺纖維化患者中相關(guān)IL-6和TNFR2的多態(tài)性報道支持膜結(jié)合TNF-α誘導(dǎo)的IL-6/sIL-6R相互作用觸發(fā)纖維化［34］。可溶性TNF主要通過TNFR1發(fā)出信號，是IL-6的強誘導(dǎo)劑。健康對照組和SSc患者在CD3/CD28刺激后，促纖維化細(xì)胞因子IL-13的產(chǎn)生差異較小，而TNF刺激后IL-13的產(chǎn)生增加。CD3/CD28與TNF共刺激SSc患者真皮T淋巴細(xì)胞上清液誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中1型膠原表達(dá)增高。因此，SSc組織中的T淋巴細(xì)胞過度表達(dá)TNFR2，而來自SSc患者的預(yù)先激活的外周血來源淋巴細(xì)胞是促纖維化的。通過兩種TNF-α受體，尤其是TNFR2共同刺激T細(xì)胞，進(jìn)一步觸發(fā)膠原蛋白的生成［33］。TNF-α通過免疫調(diào)節(jié)參與纖維化機制如圖1所示。

圖1 TNF-α參與纖維化的作用機制Fig.1 Involvement mechanism of TNF-α in fibrosis

4.5 TNF-α在SSc中的表達(dá)PEHLIVAN等［35］證實了SSc患者血清中TNF-α水平升高，另一方面，SSc患者的TNF-α mRNA表達(dá)比正常對照組高2.66倍［36］。與其研究結(jié)果相同的是，還有其他研究顯示SSc患者的TNF-α mRNA表達(dá)和血清中TNF-α水平更高［35］。在美國SSc患者中進(jìn)行的一項研究發(fā)現(xiàn)腎臟危象患者的血清TNF-α水平較高［37］。

4.6 TNF-α基因多態(tài)性與SSc易感性的關(guān)系在TNF-α基因（編碼TNF-α）的啟動子區(qū)，基因-308G>A（rs1800629）和-238G>A（rs361525）多態(tài)性與TNF-α的轉(zhuǎn)錄增加有關(guān)。一些關(guān)于TNF-α多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)不同人群中-308G>A和-238G>A多態(tài)性與SSc風(fēng)險之間的關(guān)系。在墨西哥人口研究中評估了TNF-α-308G>A和-238G>A多態(tài)性與SSc易感性、TNF-α mRNA表達(dá)、TNF-α水平和SSc患者臨床變量之間的關(guān)系。根據(jù)共顯性遺傳模型，發(fā)現(xiàn)-308G>A多態(tài)性的遺傳基因型是SSc易感性的遺傳標(biāo)記，而且與皮膚厚度和抗纖維蛋白原抗體水平有關(guān)，這些數(shù)據(jù)表明TNF-α通過自身抗體和纖維化的產(chǎn)生在SSc易感性中起著重要作用，但是沒有發(fā)現(xiàn)-238G>A多態(tài)性與疾病之間的關(guān)聯(lián)風(fēng)險［36］。這些結(jié)果與土耳其人口研究的結(jié)果一致［38］；然而，這與日本人群研究結(jié)果不同，在日本人群中沒有發(fā)現(xiàn)這兩種TNFα多態(tài)性與SSc風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián)。一項在意大利進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)了-238G>A基因型多態(tài)性與SSc易感性，特別是與dSSc表型之間的關(guān)聯(lián)［39］。TNF-α基因多態(tài)性和SSc風(fēng)險之間的這些異質(zhì)性關(guān)聯(lián)可以通過每個被評估人群的遺傳結(jié)構(gòu)來解釋，眾所周知，這是導(dǎo)致人群之間疾病發(fā)病率差異的原因。

5 TNF-α抑制劑在SSc中的治療作用

TNF-α抑制劑用于治療慢性免疫疾病或炎癥性疾病，其無論是作為單一藥物治療，還是與其他抗炎藥物或改善疾病的抗風(fēng)濕藥物聯(lián)合治療，已經(jīng)在大型隨機對照臨床試驗中證明有效。臨床上應(yīng)用得較多的TNF-α抑制劑有：英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗和依那西普，這些藥物均可阻斷TNF-α的生物學(xué)作用；但他們在結(jié)構(gòu)、藥代動力和作用機制上存在一定的差異。

TNF-α抑制劑在治療SSc中的潛在作用是由于這種慢性免疫介導(dǎo)的疾病中TNF-α的過度表達(dá)。PHUMETHUM等［40］發(fā)現(xiàn)英夫利昔單抗和依那西普可改善SSc患者的炎性關(guān)節(jié)炎和殘疾現(xiàn)象。PIGUET等［41］用英夫利昔單抗治療16例dcSSc，治療第26周時皮膚成纖維細(xì)胞的Ⅲ型膠原水平的血清氨基末端前肽和Ⅰ型膠原的分泌減少，表明新膠原形成減少，血清血管性血友病因子水平顯著下降。值得注意的是，血管性血友病因子水平升高與疾病嚴(yán)重程度增加有關(guān)。BOSELLO等［42］研究發(fā)現(xiàn)SSc和糜爛性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的患者對皮質(zhì)類固醇或甲氨蝶呤治療沒有反應(yīng)，而用依那西普治療卻可以減少關(guān)節(jié)腫脹和壓痛，延緩纖維化的進(jìn)展，改善指尖潰瘍。LAM等［43］證實了依那西普治療SSc患者的療效和安全性。值得注意的是，用TNF-α抑制劑治療的患者發(fā)生全身性自身免疫性疾病的風(fēng)險很低，目前沒有建議在抗TNF-α治療期間監(jiān)測自身抗體滴度。TNF-α抑制劑用于硬皮病肺纖維化和肺動脈高壓的基本原理是由于TNF-α水平的升高有利于肺間質(zhì)和血管損傷。SZEKANECZ等［44］提示依那西普和阿達(dá)木單抗可能對脂質(zhì)譜發(fā)揮有益作用，從而改善內(nèi)皮功能障礙。依那西普可以降低血清TNF-α水平，增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶的組織表達(dá)和緩激肽的血管舒張反應(yīng)。TNF-α抑制劑能夠降低VEGF、一氧化氮和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶的表達(dá)和產(chǎn)生［45］。英夫利昔單抗和依那西普可改善SSc中的炎性關(guān)節(jié)炎和殘疾。此外，TNF-α抑制劑通過降低PAH進(jìn)展和急性心血管和/或腦血管事件的風(fēng)險來改善內(nèi)皮功能。綜上所述，TNF-α抑制劑可以改善SSc患者癥狀和延緩纖維化進(jìn)展，然而，還需要對SSc患者進(jìn)行TNF-α抑制劑隨機對照試驗，以確認(rèn)TNF-α抑制劑在SSc相關(guān)關(guān)節(jié)炎治療中的潛在作用，并研究其在SSc患者的治療中對于皮膚和肺潛在的有益作用。SSc中使用TNF-α抑制劑的潛在有益作用和支持文獻(xiàn)見表1。

表1 SSc中使用的TNF-α抑制劑的潛在有益作用和支持參考文獻(xiàn)Tab.1 Potential beneficial effects and supporting refer?ences of each TNF-α inhibitor used in SSc

6 小結(jié)

SSc是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病，其發(fā)病機理和治療方法仍需進(jìn)行廣泛深入的研究。TNF-α通過調(diào)節(jié)纖維增生功能參與炎癥、纖維化、血管內(nèi)皮的激活以及免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，與SSc的發(fā)病機制存在一定的相關(guān)性。并且，通過對相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)表明TNF-α抑制劑可以改善SSc患者癥狀和延緩纖維化進(jìn)展。為了提高SSc的治療水平，尚需對TNF-α抑制劑的治療作用進(jìn)行進(jìn)一步的研究。