丹參多酚酸鹽注射液聯(lián)合瑞舒伐他汀治療老年急性心肌梗死的療效及對(duì)NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響

朱甘霖 王冬莉

(景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院，江西 景德鎮(zhèn) 333000)

急性心肌梗死(AMI)是心內(nèi)科常見病之一，梗死的發(fā)生常常源于冠狀動(dòng)脈痙攣及粥樣硬化斑塊阻塞，異常的血脂代謝、炎性損傷性血管和血管內(nèi)皮功能障礙等也是疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素〔1〕。現(xiàn)今，臨床上對(duì)于AMI的治療普遍以西醫(yī)治療為主，瑞舒伐他汀為新一代他汀藥物，其除具有強(qiáng)效降脂作用外，亦可起到抑炎、抗氧化、改善血管內(nèi)皮功能及逆轉(zhuǎn)斑塊等功能〔2〕，對(duì)疾病歸轉(zhuǎn)具有一定正面價(jià)值。中醫(yī)技術(shù)在近些年發(fā)展迅速，在AMI治療中，中醫(yī)技術(shù)能夠與西醫(yī)治療手段進(jìn)行結(jié)合，療效在一定程度上優(yōu)于傳統(tǒng)治療〔3，4〕。從丹參中能夠提取到一種名為丹參多酚酸鹽的成分，具有抗氧化、清除氧自由基、抗血小板聚集、改善血流變等多種藥效，而這些對(duì)于心血管系統(tǒng)具備很好的保護(hù)作用〔5〕。目前國(guó)內(nèi)就丹參多酚酸鹽聯(lián)合瑞舒伐他汀治療老年AMI鮮有報(bào)道，本文展開臨床對(duì)照性研究，探究其治療效果及相關(guān)可能的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取76例老年AMI患者，均于2017年10月至2019年1月收治于景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院。入組需滿足：①符合AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕，且心電圖表現(xiàn)為ST抬高；②急性起病，且病程在48 h內(nèi)；③美國(guó)紐約心臟病協(xié)會(huì)(NYHA)分級(jí)為Ⅱ～Ⅲ級(jí)；④年齡≥60歲；⑤患者知曉研究并自主簽署知情同意。需排除以下患者：①對(duì)他汀類、丹參多酚酸鹽有過敏反應(yīng)或伴有某種疾病可能影響藥物吸收；②患者合并急、慢性感染或存在嚴(yán)重凝血功能障礙；③短期內(nèi)(<90 d)接受過較大手術(shù)或短期內(nèi)腦血管意外發(fā)生；④患者合并其他較重疾病，如心力衰竭、肝腎功能不全等；⑤合并嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，并將納入病例隨機(jī)分為研究組(38例)與對(duì)照組(38例)。研究組男23例、女15例；年齡60～81歲，平均年齡為(68.06±8.86)歲；病程1～45 h，平均病程為(21.16±5.87)h；NYHA分級(jí)：Ⅱ級(jí)29例，Ⅲ級(jí)9例。對(duì)照組男22例、女16例，年齡在60～79歲；平均年齡為(69.11±9.05)歲；病程1～43 h，平均病程為(20.77±5.92)h；NYHA分級(jí)：Ⅱ級(jí)27例，Ⅲ級(jí)11例。兩組基線資料無顯著差異(P>0.05)，可進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2方法 兩組入院后均接受常規(guī)綜合治療，包括低分子肝素鈣注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字：H20000706；規(guī)格：0.4 ml∶4 000 IU)皮下注射(5 000 IU/次，2次/d)、阿司匹林腸溶膠囊(華中藥業(yè)股份有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字：H42022876；規(guī)格：0.3 g/粒)口服(300 mg/次，1次/d)、注射用尿激酶(廣東健信制藥股份有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字：H20033051；規(guī)格：2.5×106U)靜滴溶栓(2.5×106U加入200 ml生理鹽水，1次/d)。對(duì)照組：在常規(guī)綜合治療基礎(chǔ)上，額外給予患者口服瑞舒伐他汀鈣片(南京正大天晴制藥有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字H20080670；規(guī)格：10 mg/片)，進(jìn)行輔助治療。劑量為10～40 mg/次，可根據(jù)病情輕重追加。研究組在對(duì)照組基礎(chǔ)上，額外給予患者多普賽(丹參多酚酸鹽注射液，上海綠谷制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050248；規(guī)格：0.1 g/瓶)200 mg+5%葡萄糖溶液250ml通過靜脈滴注給藥，1次/d。兩組均治療滿2 w。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1檢測(cè)NF-κB p50、p65 mRNA水平 利用熒光定量PCR法(q-PCR)，首先通過酚氯仿方法在加入Trizol裂解的患者血液中提取總RNA，并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，確保OD260/280值合格。接下來將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(此步驟參照試劑盒步驟進(jìn)行)。設(shè)計(jì)合成目的基因引物，并以β-actin為內(nèi)參，同一批cDNA樣品配制q-PCR體系，上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，檢測(cè)目的基因及內(nèi)參基因的Ct值。程序結(jié)束后分析溶解曲線確保過程正確，計(jì)算樣品中目的基因mRNA水平相對(duì)表達(dá)情況2-ΔΔCt。目的基因引物由Primer軟件設(shè)計(jì)，見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3.2檢測(cè)NF-κB p50、p65蛋白表達(dá)水平 首先利用紅細(xì)胞裂解液200 μl對(duì)外周血中紅細(xì)胞進(jìn)行裂解，整個(gè)過程放于冰上約30 min，以保證裂解完全，裂解后進(jìn)行離心，3 000 r/min離心10 min，獲得上清即為細(xì)胞裂解液。用蛋白質(zhì)定量二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，確定蛋白樣本上樣量為30 μg/孔，進(jìn)行Western印跡。目的條帶的分離采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDA-PAGE)，待目的條帶分離完全，結(jié)束電泳并將凝膠的條帶轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，配制10%脫脂奶粉的封閉液，室溫條件下?lián)u床孵育2 h。封閉結(jié)束后，加入一抗抗體稀釋液，4℃過夜孵育。次日，洗凈膜，加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)的抗鼠或抗兔的二抗室溫孵1 h，利用電化學(xué)發(fā)光(ECL)掃膜儀進(jìn)行結(jié)果掃描。同樣以管家基因β-actin為內(nèi)參。采用軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。

1.3.3心肌酶譜指標(biāo) 采集同一位患者未經(jīng)治療及治療后，空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血6 ml，在37℃下恒溫水浴30 min，水浴結(jié)束離心3 000 r/min 10 min，將上清液吸出轉(zhuǎn)至-20℃冷凍保存，待集齊標(biāo)本后測(cè)定。指標(biāo)為血清中肌酸激酶(CK)、CK同工酶(CK-MB)及心肌肌鈣蛋白(cTn)I，檢測(cè)儀器為日立7080全自動(dòng)生化分析儀。

1.3.4炎癥反應(yīng)指標(biāo) 選擇白細(xì)胞介素(IL)-8、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α 3種指標(biāo)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法對(duì)1.3.3中同樣方法制備的血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5氧化應(yīng)激指標(biāo) 超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)應(yīng)用羚胺方法；丙二醛(MDA)測(cè)定應(yīng)用硫代巴比妥酸法；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定應(yīng)用比色法，對(duì)1.3.3中同樣方法制備的血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6療效判定 依據(jù)已有報(bào)道〔7〕，對(duì)于患者療效進(jìn)行判定：治療后心絞痛發(fā)作次數(shù)減少>80%，心電圖靜息恢復(fù)正常為顯效；治療后心絞痛發(fā)作次數(shù)減少50%～80%，心電圖ST 段回升≥0.05 mV，但未達(dá)正常水平為好轉(zhuǎn)；治療后心絞痛發(fā)作次數(shù)減少<500%，心電圖ST段降低超過0.05 mV為無效。總有效=顯效+好轉(zhuǎn)。

1.3.7不良反應(yīng) 對(duì)兩組不良反應(yīng)發(fā)生率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1比較兩組NF-κB p50、p65 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平 治療前，兩組NF-κB p50、p65 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，無顯著差異(P>0.05)；治療后，相比于治療前，患者NF-κB p50、p65 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，且研究組均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

2.2兩組心肌酶譜指標(biāo)比較 治療前，CK、CK-MB、cTnI水平在兩組間無顯著差異(P>0.05)；治療后，研究組與對(duì)照組CK、CK-MB、cTnI水平均明顯降低，且研究組降低更為顯著(P<0.01)。見表3。

表3 兩組心肌酶譜指標(biāo)比較

2.3兩組炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較 兩組治療前血清TNF-α、IL-8、IL-1β水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后TNF-α、IL-8、IL-1β水平在兩組中相比于治療前均明顯下降，且研究組下降更為顯著(P<0.01)。見表4。

表4 兩組炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較

2.4兩組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 兩組治療前氧化應(yīng)激水平相對(duì)一致，治療后兩組氧化應(yīng)激情況均顯著改善，SOD、GSH-Px水平均顯著上升；研究組較對(duì)照組改善更佳，回升趨勢(shì)更顯著(P<0.01)；MDA水平均顯著降低，同樣研究組降低更顯著(P<0.01)。見表5。

表5 兩組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.5兩組臨床療效比較 研究組總有效率明顯高于對(duì)照組(P=0.01)。見表6。

表6 兩組臨床療效比較〔n(%),n=38〕

2.6兩組不良心血管事件發(fā)生率比較 隨訪過程中研究組存在1例心律失常，1例血運(yùn)重建，對(duì)照組出現(xiàn)復(fù)發(fā)性心絞痛1例、血運(yùn)重建3例，研究組不良心血管事件發(fā)生率(5.26%)低于對(duì)照組(10.53%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且都在后續(xù)治療中得到緩解。

3 討 論

大多數(shù)AMI是由急性冠狀動(dòng)脈狹窄或閉塞引起的，AMI具有迅速發(fā)作，高致殘率等特點(diǎn)。如果不及時(shí)治療，很容易并發(fā)心力衰竭，休克甚至猝死，嚴(yán)重危及患者生命〔8〕。老年群體發(fā)生AMI預(yù)后情況則更差，死亡率也明顯高于年輕群體〔9〕。

本研究結(jié)果表明，說明治療中加入丹參多酚酸鹽注射液能有效減輕心肌細(xì)胞的損傷，降低細(xì)胞凋亡，阻滯心功能的不斷變化，綜合提高AMI療效，可能原因?yàn)榈⒍喾铀猁}注射液能夠一定程度上抗血小板，促進(jìn)血管的舒張，血管通透性有所增加，從而避免心肌細(xì)胞的異常結(jié)構(gòu)，保障了血液和氧氣供應(yīng)心肌，心肌功能則得到保護(hù)。

臨床試驗(yàn)報(bào)道〔10〕，在AMI發(fā)生及進(jìn)展的過程中，NF-κB炎癥信號(hào)通路激活，這一病理機(jī)制其既能相對(duì)穩(wěn)定心臟內(nèi)環(huán)境，又能夠介導(dǎo)病原特異性應(yīng)答。NF-κB信號(hào)通路涉及多個(gè)分子，調(diào)控多種生理病理過程，其激活機(jī)制也相對(duì)復(fù)雜。正常靜息狀態(tài)時(shí)，其細(xì)胞質(zhì)中存在形式為p50/p65二聚體，其抑制蛋白IκB可與這兩個(gè)亞基的同源和(或)異源二聚體上再結(jié)合，形成三聚體，但不具有活性〔11〕。發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，NF-κB受到炎癥反應(yīng)刺激激活，誘導(dǎo)大量的TNF-α和IL-1β分泌，進(jìn)而激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物IKKs，IKKs則可以磷酸化靜息狀態(tài)下無活性的p50/p65/IκB三聚體IκB亞基調(diào)節(jié)位點(diǎn)的絲氨酸，為IκB亞基增添泛素化，從而經(jīng)蛋白酶途徑降解，釋放出p50/p65，使二者發(fā)生核轉(zhuǎn)位并與結(jié)合到相應(yīng)靶基因上的κB位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。林慶賓等〔12〕研究結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷病情進(jìn)展會(huì)使得TNF-α、IL-8、IL-1β這3種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)持續(xù)升高，因此該指標(biāo)可以有效地反映疾病的嚴(yán)重程度。TNF-α和IL-1β在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)大量分泌，再進(jìn)一步激活炎性細(xì)胞，這種炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)對(duì)于遠(yuǎn)隔臟器的功能亦具有損傷效果，損傷后再次正反饋激活NF-κB，加劇了細(xì)胞內(nèi)膜和基底膜的受損，血管阻力和心臟后負(fù)荷隨之增加〔13〕。IL-8被NF-κB的過表達(dá)激活和釋放，可以在心臟中誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和T細(xì)胞積蓄，同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量蛋白酶，這都對(duì)心肌組織有直接損害，從而加重病情〔14〕。以上均表明，AMI患者在這樣的炎性損害中長(zhǎng)期循環(huán)，而患有AMI的老年群體，他們除了AMI損傷外，本身患有基礎(chǔ)性、慢性炎性疾病，因此老年人受到NF-κB活化所造成的炎性損害循環(huán)更嚴(yán)重，對(duì)于老年群體AMI的治療，抑制NF-κB的激活或許是其治療的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明，丹參多酚酸鹽注射液聯(lián)合瑞舒伐他汀對(duì)于減少炎癥反應(yīng)中炎性因子釋放、抑制炎癥反應(yīng)激活的NF-κB信號(hào)通路均顯示出良好的作用。

根據(jù)有關(guān)報(bào)道〔15〕，炎癥反應(yīng)發(fā)生會(huì)使炎性細(xì)胞發(fā)生“呼吸爆發(fā)”，在這一過程中釋放了大量的氧自由基，從而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)氧化，打破了機(jī)體氧化與抗氧化作用之間的平衡，損害心肌細(xì)胞脂質(zhì)，引起冠脈流量減少，加重病情。本研究結(jié)果表明，丹參多酚酸鹽注射液聯(lián)合瑞舒伐他汀可抑制機(jī)體的氧化應(yīng)激，促使心肌細(xì)胞恢復(fù)耗氧/抗氧化平衡。這主要與丹酚酸鹽和瑞舒伐他汀對(duì)血液黏度和冠狀動(dòng)脈血流的改善有關(guān)。 本研究對(duì)患者在藥物使用期間的安全性也進(jìn)行觀察，不良心血管事件在兩組中均有發(fā)生，研究組發(fā)生率略低于對(duì)照組，本研究認(rèn)為這可能與瑞舒伐他汀的長(zhǎng)期治療有關(guān)，可能會(huì)產(chǎn)生心絞痛，血液循環(huán)重建和其他不良心血管事件，而本研究將丹參多酚酸鹽注射液與瑞舒伐他汀序貫治療后，可在一定程度上減短瑞舒伐他汀治療周期。

綜上所述，丹參多酚酸鹽注射液聯(lián)合瑞舒伐他汀對(duì)于減輕老年AMI患者心肌損傷有顯著效果，藥物作用過程中炎性因子釋放、NF-κB炎癥信號(hào)通路活化受到抑制，機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)有所改善，進(jìn)而減輕患者心肌損傷。盡管得出有效結(jié)論，但由于有限的病例數(shù)，在樣本的選擇上也存在著一定的偏倚，在后續(xù)的研究中，應(yīng)結(jié)合臨床實(shí)際情況，針對(duì)改善老年AMI治療方案及療效，探究相關(guān)作用機(jī)制，進(jìn)行長(zhǎng)期的、包括更多前瞻性、大樣本、多中心的研究，為優(yōu)化老年AMI臨床治療建立研究基礎(chǔ)。