西紅花酸對白細胞介素-1β誘導的髓核細胞退變的影響

岳宗進 于露 劉汝銀 馮仲鍇 王新立 王西彬 魯花

(河南省中醫院 河南中醫藥大學第二附屬醫院脊柱科，河南 鄭州 450002)

腰痛是一種常見的肌肉骨骼疾病，嚴重影響了人類的生活質量，給社會造成了巨大的經濟負擔〔1〕。椎間盤退變(IDD)被認為是引起腰部疼痛的主要原因，是脊柱退變性疾病的病理基礎，以中老年發病居多，具有較高的發病率及致殘率。髓核(NP)細胞是構成椎間盤的主要細胞，在正常情況下可通過分泌Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)，聚集蛋白聚糖及基質金屬蛋白酶(MMPs)等參與細胞外基質(ECM)的合成及分解動態平衡進程。多項研究表明，IDD與炎癥、NP細胞凋亡及ECM降解息息相關〔2～4〕。西紅花酸是從中藥番紅花屬植物西紅花中提取出來的主要有效成分，屬類胡蘿卜素類物質，具有多不飽和共軛烯酸結構。研究證實西紅花酸有抗氧化應激、抗細胞損傷、降血糖及抗炎等功效〔5，6〕。此外，西紅花酸處理可加強脊髓損傷大鼠海馬神經元軸突的生長，從而促進大鼠脊髓損傷功能恢復〔7〕。同時，西紅花酸還可通過抑制氧化應激及神經炎癥減緩神經病理性疼痛進程〔6〕。但是，西紅花酸在IDD中的作用尚不明確。因此，本研究探討西紅花酸對NP細胞損傷、炎癥應答及ECM代謝的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人NP細胞系(HNPC)購自上海鈺博生物科技有限公司(YB-ATCC-3536)；噻唑藍(MTT)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(G020-1-1)；一鏈cDNA合成試劑盒購自Fermentas公司(K1622)；RIPA裂解液(P0013B)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062M)購自上海碧云天；ECL底物液購自Thermo公司(NCI5079)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司(IPVH00010)；白細胞介素(IL)-6(ab178013)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(ab181421)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、抗人MMP-3、MMP-13、p-p65核因子(NF)-κB、p-IκB及β-actin抗體購自Abcam公司。

1.2細胞的培養和處理 將HPNC置于含10%胎牛血清(FBS)及100 U/ml青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中，所有細胞在37℃、5%CO2條件下進行孵育。

1.3細胞的處理及實驗分組 采用IL-1β處理體外模擬NP細胞退變微環境，將細胞分為以下幾組：①對照組：正常培養HPNC；②IL-1β組：用10 ng/ml的IL-1β處理HPNC 24 h；③西紅花酸組：設置5、10、50、100及200 μmol/L濃度處理12 h；④IL-1β+西紅花酸組；用50 μmol/L的西紅花酸及IL-1β處理細胞。

1.4MTT檢測細胞活性 在96孔培養板中按100 μl/孔加入細胞懸液，將其放置待細胞融合度達80%左右時，加入不同濃度的西紅花酸、10 ng/ml的IL-1β作用24 h；每孔加入50 μl 1×MTT試劑，37℃下孵育4 h，使MTT還原為甲臜；棄去上清后加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)溶液，搖床下作用15 min；酶標儀檢測570 nm的吸光光度值，評估細胞活性。

1.5流式檢測細胞凋亡 收集不同處理組細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清；用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞，離心后加195 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞；加入5 μl的 Annexin V-FITC溶液，輕輕混勻后再加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液；室溫(20～25℃)下避光孵育15 min，將樣品置于FACSCalibur流式細胞儀上，評估不同處理對細胞凋亡的影響。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測mRNA水平 用Trizol裂解液抽提細胞總RNA，按照cDNA合成試劑盒說明書將抽提到的RNA逆轉錄合成cDNA；以合成的cDNA為模板，加入0.4 μl的ROX Reference Dye Ⅱ、特異性上下游擴增引物(0.8 μl)及10 μl的SYBR?Premix EX TaqTM Ⅱ構建qPCR體系，按照如下程序進行PCR：95℃ 30 s，循環1次；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環40次。其中以β-actin為內參，采用2-△△CT評估目的基因mRNA水平，特異性擴增引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴增引物序列

1.7ELISA檢測IL-6、TNF-α水平 收集對照組、IL-1β處理組、IL-1β和西紅花酸處理組細胞，按照IL-6、TNF-α的ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測細胞培養液中IL-6、TNF-α的濃度。

1.8Western印跡檢測蛋白表達 采用RIPA裂解抽提不同處理組細胞總蛋白，按照BCA蛋白檢測試劑盒說明書對抽提的蛋白進行定量分析；將等量目的蛋白樣品用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離電泳，隨后將目的蛋白電轉移至PVDF膜上；加入5%脫脂奶封閉膜上的非特異性反應，隨后加入抗人MMP-3、MMP-13、p-IκB、p-p65 NF-κB的一抗，4℃下過夜孵育；用TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1.5 h；加入ECL溶液進行顯色成像，以β-actin為內參，用Image J軟件對蛋白密度進行量化分析，結果以目標蛋白與β-actin比值表示。

1.9統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t法。

2 結 果

2.1西紅花酸對HNPC存活的影響 MTT分析顯示，與對照組HNPC活性〔(99.67±3.96)%〕相比，西紅花酸濃度在5，10，50 μmol/L時可劑量依賴性地增加HNPC活性〔(118.43±2.95)%、(133.53±7.13)%、(141.17±6.88)%〕，且在50 μmol/L西紅花酸組活性最強(P<0.05)；西紅花酸濃度在100、200 μmol/L時HNPC活性〔(112.30±2.80)%、(79.93±5.20)%〕逐漸降低，且在200 μmol/L濃度時顯著性抑制細胞活性，提示其在此濃度時具有細胞毒性(P<0.05)。

2.2西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC存活及凋亡的影響 MTT分析顯示，與對照組HNPC存活率〔(98.47±4.16)%〕相比，IL-1β處理后可顯著性抑制HNPC的存活率〔(54.37±2.55)%，P<0.05〕，而西紅花酸(5、10、50、100 μmol/L)可劑量依賴性增加IL-1β組存活率〔(64.67±5.24)%、(69.33±4.85)%、(83.33±5.42)%、(73.20±2.96)%〕，且50 μmol/L西紅花酸對細胞存活率的促進作用最強(P<0.05)。同時，IL-1β處理后凋亡率從(5.34±1.09)%上升至(35.20±2.95)%，用50 μmol/L西紅花酸后細胞凋亡率下降至〔(13.57±1.92)%,P<0.05〕。

2.3西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC炎性因子表達的影響 與對照組相比，IL-1β處理明顯上調細胞中IL-6、TNF-α的轉錄及產生，而西紅花酸處理后可顯著性抑制IL-1β誘導的上述炎性因子的mRNA及釋放(P<0.05)，見表2，表3。

表2 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中IL-6和TNF-α mRNA水平影響

表3 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中IL-6和TNF-α分泌水平影響

2.4西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中MMP-3、MMP-13表達的影響 與對照組相比，IL-1β組MMP-3、MMP-13的蛋白表達水平明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；而西紅花酸處理后可顯著性降低IL-1β誘導的MMP-3及MMP-13蛋白表達(P<0.05)。見圖1，表4。

1～3：對照組、IL-1β組、IL-1β+西紅花酸組，下圖同圖1 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中MMP-3、MMP-13表達的影響

表4 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中MMP-3和MMP-13蛋白表達水平影響

2.5西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中Collagen Ⅱ及aggrecan轉錄的影響 IL-1β處理顯著性抑制Collagen Ⅱ及aggrecan的mRNA水平(P<0.05)；與IL-1β組相比，西紅花酸處理后細胞中Collagen Ⅱ及aggrecan的mRNA水平明顯增加(P<0.05)。見表5。

表5 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中Collagen Ⅱ、aggrecan mRNA的影響

2.6西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中NF-κB信號通路活化的影響 與對照組相比，IL-1β處理組中p-IκB、p-p65 NF-κB表達水平明顯上調，差異有統計學意義(P<0.05)，而西紅花酸作用后IL-1β處理的細胞中p-IκB、p-p65 NF-κB的表達水平顯著性降低(P<0.05)，提示西紅花酸可抑制IL-1β誘導的髓核細胞中NF-κB信號通路的活化。見圖2、表6。

圖2 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中NF-κB信號通路活化的影響

表6 西紅花酸對IL-1β誘導的HNPC中p-IκB和p-p65蛋白表達水平影響

3 討 論

近年來隨著社會老齡化的加劇，椎間盤突出癥的發病率逐年上升，是影響中老年腰疼痛的主要因素，已成為影響人類健康的重要問題〔8〕。位于椎間盤中間的NP細胞是IDD的主要參與者，其數目的減少與IDD進程息息相關〔8，9〕。

在IDD進程中，位于中央的NP組織處于低營養及高IL-1β的炎性應激環境中〔10〕。多項研究證實，IL-1β是IDD的重要參與者，可通過調控NP細胞的凋亡、炎性因子的產生及胞外基質的降解等加重椎間盤病變進程〔11～13〕。目前，多數研究已通過IL-1β刺激體外模擬NP細胞退變微環境〔4，11〕。因此，本研究用IL-1β處理NP細胞，與前期研究類似〔7〕，IL-1β處理抑制了NP細胞的存活，誘發細胞凋亡。然而，西紅花酸可劑量依賴性上調IL-1β處理的細胞存活率，降低細胞凋亡。楚溪等〔14〕證實，西紅花酸可抑制心肌細胞的氧化應激損傷，從而減緩大鼠心肌缺血性損傷。此外，Wang等〔2〕證實，減緩NP細胞的凋亡及胞外基質的降解有利于減緩IDD進程。

本研究進一步發現，IL-1β可誘導NP細胞中炎性因子IL-6及IL-8的產生。研究證實，多種促炎性因子如IL-6、IL-1β等參與了IDD及疼痛進程〔3，12〕。已知退變的椎間盤組織可自發分泌IL-6、IL-8等，從而導致細胞凋亡及基質金屬蛋白抑制因子(TIMPs)的降低或失活，導致MMP-3等大量產生，從而參與IDD調控。而IL-1β是IDD的關鍵炎性因子，不僅可調控炎性因子的產生，還可通過抑制NP細胞存活及MMPs的產生促進胞外基質降解，從而加重IDD〔11～13〕。已知椎間盤胞外基質由Collagen及aggrecan等構成，而退變環境下大量MMPs的產生及胞外基質合成障礙的發生導致胞外基質合成及分解平衡被打破，從而引發IDD。本研究證實，西紅花酸可以抑制IL-1β誘導的MMP-3、MMP-13的表達，同時減緩IL-1β對Collagen Ⅱ及aggrecan表達的抑制效應，提示西紅花酸可調控IL-1β誘導的NP細胞胞外基質代謝紊亂。

NF-κB是已知的重要炎性信號調節通路，在多種炎性相關疾病中被過度激活，可通過調控存活相關分子、炎癥因子及MMPs等參與多種炎性疾病的調控〔15～17〕。Lu等〔4〕證實，靶向NF-κB通路可抑制IL-1β誘導的胞外基質的降解及NP細胞的凋亡。本研究發現，西紅花酸處理抑制了IL-1β誘導的NP細胞中NF-κB信號通路的活化。Yang等〔18〕證實，西紅花酸可通過抑制NF-κB通路減緩脂多糖LPS誘導的小鼠急性肺損傷。Huang等〔15〕發現，阻斷NF-κB信號通路可減緩小鼠體內的炎癥應答、氧化應激及NP細胞的衰老進程，從而抑制IDD過程。

綜上，一定濃度的西紅花酸對NP細胞無毒性，且可抑制IL-1β誘導的NP細胞凋亡、炎性因子產生及胞外基質的代謝紊亂，且可能是通過阻斷NF-κB信號通路來實現的。