金納多對血管性癡呆大鼠認知功能、海馬區細胞凋亡及炎性因子的影響

孫微 王一帆 張佳月

(深圳市薩米醫療中心，廣東 深圳 518118)

血管性癡呆主要是各種腦血管因素導致的一種智能損害綜合征，以認知功能、記憶功能缺損為主，可伴人格障礙、視空間技能障礙及語言障礙〔1,2〕。血管性癡呆是危害中老年人健康的一種疾病，具有較高發病率，成為全世界面臨的重大醫學和社會問題，嚴重影響人們的生存質量〔3,4〕。但目前關于血管性癡呆具體發病機制尚未完全闡明，認為其發病多與機體海馬區域神經元損傷凋亡、炎性反應及氧化應激等方面有關，且國內外尚無特效的治療血管性癡呆藥物，是醫學界研究的難題之一。中醫藥具有多靶點、多環節的作用，在防治各類腦血管疾病具有巨大優勢和特色〔5,6〕。金納多又為銀杏葉提取注射物片，具有活血化瘀、通路功效，主要用于腦部、周邊和冠狀血流循環障礙。本研究探討金納多對血管性癡呆大鼠認知功能、海馬區細胞凋亡及炎性因子影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 SPF級雄性SD大鼠36只，體質量(220±20)g，適應性飼養1 w，自由進食飲水，控制溫度20～25℃，控制濕度50%～70%，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2007-0001。金納多(生產廠家：Dr.Willmar-SchwabeGmbH&Co.KG；批準文號：注冊證號H20140768)。

1.2主要試劑和儀器 主要試劑：兔抗Bcl-2抗體(Santa Cruz公司)，兔抗Bax抗體(Santa Cruz公司)，大鼠白細胞介素(IL)-1β、IL-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司)。主要儀器：1510型酶標儀(廠家：美國Thermo公司)，Morris水迷宮實驗系統(廠家：淮北正華生物儀器設備有限公司)，電泳儀(廠家：成都一科儀器設備有限公司)。

1.3血管性癡呆模型制備 采用3%戊巴比妥鈉注射液(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，沿大鼠頸正中線切口切開皮膚，分離雙側頸總動脈與迷走神經。以0號手術線從血管下穿過，結扎右側頸動脈結扎。再對頸部手術切口進行縫合且腹腔注射10萬U青霉素注射液，放回籠中常規飼養。3 d后將頸部手術線拆除，結扎大鼠左側頸動脈且進行縫合。以跨域平臺時間限制延長，跨越平臺次數限制少于正常大鼠，反應遲鈍，精神變差為造模成功標準。實驗過程中，無大鼠死亡，均造模成功。

1.4實驗分組及干預方法 隨機分為正常組、模型組和實驗組，每組12只。正常組和模型組給予等劑量生理鹽水尾靜脈注射，1次d；實驗組給予金納多10 mg/(kg·d)尾靜脈注射，1次/d。各組連續2 w。

1.5海馬組織形態學 取大鼠海馬組織，采用蘇木素-伊紅(HE)染色，具體操作流程包括組織固定→脫水→透明→浸蠟→石蠟包埋→切片、撈片、展片→脫蠟→染色，觀察其形態學變化。

1.6認知功能評價 認知功能采用Morris水迷宮實驗和敞箱實驗評價。(1)Morris水迷宮實驗：分為4個象限，將2 cm的浸沒式逃生平臺放置在與側壁和池中心等距的一個象限中間。以大鼠訓練找到平臺，記錄所需時間，每只大鼠每日4次實驗，連續4 d。獲取逃避潛伏期和經過原平臺位置的次數。(2)敞箱實驗：將大鼠放入敞箱正中，其中垂直活動得分為大鼠雙足離開底面直立次數，而水平活動得分為大鼠三足跨入鄰格的次數，測定5 min內大鼠垂直活動得分和水平活動得分。

1.7Western印跡測定神經元凋亡相關蛋白表達 麻醉大鼠，冰上操作迅速分離海馬，根據組織與蛋白提取劑1∶10(g/ml)比例稀釋，裂解組織。于4℃低溫條件下離心15 min，收集上清液，測定蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，將含目的蛋白的一抗Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200)孵育于4℃下過夜。采用1×TBST溶液漂洗，再于耦聯辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG(1∶5 000)放置室溫下作用2 h。采用ECL化學發光法顯影，內參選擇β-actin，蛋白相對量表示為目的蛋白條帶的平均吸光度值與β-actin的平均吸光度值的比值。

1.8海馬組織炎性因子測定 取大鼠腦組織，快速剪取右側海馬組織，稱重大鼠海馬組織后放置液氮速凍后置入-80℃冰箱保存待測。取海馬組織加入二羥基苯甲酸，放置于冰浴上超聲勻漿30 s，以15 cm半徑，15 000 r/min低溫離心12 min，取上清液，采用酶聯免疫吸附試驗測定海馬組織IL-1β、IL-8和TNF-α水平，嚴格依據試劑盒說明書標準測定。

1.9統計學處理 采用SPSS23.0軟件行t檢驗、F檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠海馬組織形態學比較 模型組海馬區神經元大量死亡、變性，細胞體積縮小，核固縮、碎裂明顯、深染，胞質濃縮呈深紅色染色；實驗組較模型組海馬區神經元變性和死亡明顯減輕，且大鼠海馬區神經元胞體縮??；正常組海馬區神經元排列規則，胞核較大，胞質豐富。見圖1。

圖1 各組海馬組織形態學(HE染色，×400)

2.2各組逃避潛伏期和經過原平臺位置次數比較 模型組和實驗組逃避潛伏期長于正常組且經過原平臺位置次數多于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；實驗組逃避潛伏期短于模型組且經過原平臺位置次數多于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組逃避潛伏期和經過原平臺位置的次數

2.3各組大鼠敞箱實驗積分比較 模型組和實驗組垂直運動和水平運動評分低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；實驗組垂直運動和水平運動評分高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組敞箱實驗積分比較次/min，n=12)

2.4各組大鼠海馬組織Bax和Bcl-2蛋白比較 模型組和實驗組海馬組織Bax表達高于正常組，而Bcl-2表達低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；實驗組海馬組織Bax表達低于模型組，而Bcl-2表達高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 各組海馬組織Bax和Bcl-2蛋白表達灰度值比較

圖2 各組海馬組織Bax和Bcl-2蛋白表達

2.5各組大鼠海馬組織炎性因子比較 模型組和實驗組海馬組織IL-1β、IL-8和TNF-α水平高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；實驗組海馬組織IL-1β、IL-8和TNF-α水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組海馬組織陽性因子比較

3 討 論

血管性癡呆很大程度上損害了患者身心健康，嚴重影響人們生活質量，且給社會和家庭造成沉重的經濟及精神負擔〔7，8〕?，F代醫學認為，血管性癡呆發病多與興奮性氨基酸毒性作用、膽堿能功能障礙、胞質內鈣離子濃度超載及海馬區域神經元損傷凋亡等方面有關〔9，10〕。目前，臨床上關于血管性癡呆治療中，西藥主要應用膽堿酯酶抑制劑、抗氧化劑、鈣離子通道阻滯劑及改善血液循環藥等，但其臨床療效并不十分理想〔11〕。

中醫學歷史悠久，對癡呆最早追溯于《華佗神醫秘傳》，見于“文癡”“呆病”“健忘”等范疇，認為其病機多為痰瘀內阻、氣虛血阻、腎精虧虛、髓海不足、脾氣虧虛及神機失用等。依據絡病學說理論，氣虛依靠腦絡的滲灌、經脈的傳輸對腦的滋養、充灌功能。金納多主要為中草藥銀杏葉提取物，具有通經止痛、活血化瘀等功效〔12，13〕?，F代藥理研究表明，金納多具有調節血管活性、抗血小板聚集、抗氧化、清除自由基、抗炎及調節血管活性等多種作用；金納多對穩定細胞膜，減少血管緊張素的滲透，改善缺血患者的微循環及缺血損傷具有很好的保護作用〔14，15〕。本研究表明，金納多可改善血管性癡呆大鼠認知功能。

血管性癡呆學習能力下降一個重要原因是因腦缺血時海馬神經元損傷。而其中海馬是人類學習功能的重要功能，在細胞凋亡的基因調控中，Bcl-2家族成員具有重要作用，而其家族成員可分為抗細胞凋亡基因Bcl-2與促細胞凋亡基因Bax。Bcl-2在中樞神經系統中是有效的一種抑制神經元壞死和凋亡的因子，能夠促進神經元存活和突出的發生〔16，17〕。本研究表明，金納多可通過下調Bax表達及上調Bcl-2表達而抑制海馬區細胞凋亡。

炎性因子表達貫穿于血管性癡呆發生、發展全過程〔18〕。IL-1β、IL-8和TNF-α表達與癡呆嚴重程度關系緊密。各種炎性細胞因子生物學效應較為復雜，同時具有一定協同性，且炎性細胞因子間相互誘生如IL-1β和TNF-α均可誘發IL-8表達，從而形成級聯反應，且能夠通過激活中性粒細胞、單核-巨噬細胞等，增強其吞噬殺傷功能，從而加重局部炎癥反應，加重缺血性腦損傷〔19，20〕。本研究表明，金納多可通過降低IL-1β、IL-8和TNF-α水平而減輕炎性反應。

綜上，金納多可改善血管性癡呆大鼠認知功能，抑制海馬區細胞凋亡及減輕炎性反應。