串聯質譜技術檢測孕婦膽汁酸譜的性能評估及其參考區間建立*

陳 辰，陳亞軍，蔣翠蓮，馬金飛，李義坤，鐘天鷹△

1.南京醫科大學附屬婦產醫院/南京市婦幼保健院檢驗科,江蘇南京 210004；2.杭州凱萊譜醫學檢驗實驗室,浙江杭州 310000

肝臟是人體重要的代謝器官，肝細胞以膽固醇為原料合成膽汁酸經膽管排入十二指腸，協助脂類物質完成消化吸收后，再通過門靜脈回流被肝臟重吸收，形成膽汁酸的“腸肝循環”[1-2]。膽汁酸的組成和結構較為復雜，按結構可分為兩大類,一類是游離型膽汁酸[3-4],包括膽酸(CA)、 脫氧膽酸(DCA)、 鵝脫氧膽酸(CDCA)、 熊脫氧膽酸(UDCA)和石膽酸(LCA)[5]；另一類是結合型膽汁酸[6],為游離型膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸的結合物[7]。多種不同類型的膽酸共同構成了膽汁酸譜。一旦肝臟或膽囊發生病變，如肝炎、肝硬化、膽石癥、妊娠期膽汁淤積癥(ICP)等，膽汁酸的“腸肝循環”受阻，血液中的膽汁酸水平升高，這些疾病的總膽汁酸(TBA)升高水平可能接近，但膽汁酸譜的成分不同，測定TBA水平對肝膽疾病的鑒別有局限性。因此，膽汁酸譜亞型檢測對于肝膽疾病的診斷和治療具有十分重要的意義。近年來有研究表明，通過質譜技術對膽汁酸譜亞型進行測定，可以有效提高肝膽疾病的診斷效率[5]。由于以往的測定方法比較煩瑣，并且沒有適合于特定人群(如孕期、兒童)的膽汁酸譜參考區間，限制了其在臨床實驗室的推廣應用。本研究擬建立一種基于高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)技術的血清膽汁酸譜檢測方法，并進行性能評估，有利于孕期不同肝膽疾病的鑒別診斷，并建立適合于孕期的膽汁酸譜參考區間，以便更及時、有效地對孕期肝膽疾病進行干預。

1 資料與方法

1.1儀器與試劑 儀器：ABsciex 4500三重四極桿質譜儀，Jasper系列高效液相色譜儀(美國ABsciex公司)；試劑：甲醇(HPLC級，美國Merk公司)，乙酸銨(MS級，美國SIGMA公司)，樣本前處理試劑(含氘代內標的甲醇溶液)購自迪安生物有限公司，純凈水為市售屈臣氏蒸餾水。

1.2混合標準品溶液配置 膽汁酸亞型標準品購自美國SIGMA公司，制成混標溶液后逐級稀釋為7種濃度梯度(S1～S7濃度比為：1∶2∶5∶20∶50∶100∶200)，各亞型濃度見表1。

表1 混標溶液各濃度點各亞型膽汁酸濃度(ng/mL)

1.3樣本收集 隨機選取南京醫科大學附屬婦產醫院2018年7-8月產科門診某診室所有孕中期初次常規產前檢查表觀健康孕婦。納入標準：年齡22～40歲，孕周14～28周。剔除標準：肝膽疾病、肝功能異常，心血管疾病及腎臟病等慢性病，以及吸煙、酗酒等不良生活習慣。空腹抽血后立即離心，剔除溶血、脂血樣本于-80 ℃保存，共146例入組。隨機選取其中126例用于建立15種亞型參考區間，其余20例用于驗證參考區間。

1.4方法

1.4.1樣本處理 取50 μL樣本，加入120 μL前處理液，漩渦10 min，4 ℃下14 000 r/min離心10 min，吸取上清液100 μL待測。

1.4.2色譜條件 安捷倫Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm,5 μm)色譜柱；柱溫50 ℃；流動相A：純凈水，流動相B：純甲醇(HPLC級，含5 mmol/L乙酸銨)；流速：0.85 mL/min,采用梯度洗脫：0.0～0.8 min,65% B，0.8～2.8 min,65%～82% B，2.8～3.2 min,82%～83% B，3.2～5.3 min,83%～85% B，5.3～5.4 min,85% B，5.4～7.5 min,85%～98% B，7.5～9.0 min,65% B。進樣量：10 μL。

1.4.3質譜條件 電噴霧離子源、負離子掃描模式、MRM多反應監測模式、離子源溫度550 ℃。15種膽汁酸亞型質譜優化參數及保留時間見表2。

表2 15種膽汁酸亞型質譜優化參數及保留時間

1.5性能評估 參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)C62-A 文件[8]和美國食品藥品監督管理局的生物分析方法驗證導則標準[9]對建立的LC-MS/MS技術測定膽汁酸譜的方法進行基本分析性能驗證。

1.5.1最低定量限(LLMI)和最低檢出限(LoD) 取混合標準品溶液S1，稀釋至1/4S1、1/8S1，3種濃度重復測定10次，分別計算15種亞型10次測定結果的平均值，計算標準差(s)、變異系數(CV)、偏倚(Bias)，以CV<20%，Bias<15%，S/N>20為LLMI可接受標準，以CV<20%，Bias<15%，S/N>3為LoD可接受標準[8]。

1.5.2線性評價 將混合標準品溶液S6濃度作為高值(H)，S2濃度作為低值(L)，按照4H、3H+L、2H+2L、3L+H、4L配制成5種不同濃度的溶液，每種濃度重復檢測5次，計算均值、CV、與理論值的Bias，CV<15%、Bias<15%，計算出回歸方程，且r2>0.99,即可判為線性[8]。

1.5.3準確度評價 健康人混合血漿混勻后取3份，每份1 mL，分別添加不同體積的混合標準品S1溶液(10、30、100 μL)，檢測樣本中15種膽汁酸亞型濃度，每份樣本重復檢測5次取均值，計算加標回收率，并與理論值進行比較，計算Bias。Bias<15%，且加標回收率需滿足80%～120%，即判斷為可接受[8]。

1.5.4精密度評價 批內精密度：健康人混合血漿混勻后取3份，每份1 mL，分別添加相同體積不同濃度的混合標準品溶液(S2、S4、S6)，制成低值、中值、高值樣本，檢測3份樣本中15種膽汁酸亞型水平，每份樣本重復檢測20次取均值，計算s和CV，CV<15%即判斷為可接受。批間精密度：將上述加標處理后的3份血漿分別用EP管分裝，-20 ℃冰凍保存，使用前37 ℃快速復融，使用相同批號的試劑每天測定4次，連續5 d，計算s和CV，CV<15%即判斷為可接受。

1.5.5攜帶污染情況 采用混合標準品溶液S3、S5、S7依次進樣后，用甲醇作為空白樣本進樣，測定空白的峰面積響應，連續反復5次，以每次測得的峰面積響應值小于LoD響應值的25%為通過標準[8]。

1.6本地區正常孕婦膽汁酸譜參考區間的建立和驗證 根據CLSI EP28-A3c[9]文件推薦的方法和程序，采用Dixon法剔除離群值后，最終入組126例，擬建立適合于南京地區表觀健康孕中期孕婦膽汁酸譜各組分參考區間。根據小樣本驗證法[10]，選擇剩余20例參考個體進行檢測，將結果與待驗證的參考區間進行比較，若超出參考區間的數據不超過2例，則通過驗證；如超過2例，則另選擇20例合格參考個體重復以上驗證過程。

2 結 果

2.1LLMI和LoD 稀釋標準品，當標準品濃度為混合標準品濃度S1時，重復檢測10次，滿足每種亞型CV均<15%,且S<10%，信噪比>20∶1，各種亞型的LLMI為混合標準品曲線中S1的濃度。而濃度在1/4 S1時，信噪比滿足>3∶1，CV和s滿足LoD的要求，但不能滿足LLMI的要求，故1/4 S1濃度為該膽汁酸譜檢測方法的LoD。

2.2線性范圍 通過7種不同的濃度點構建標準曲線。以質量濃度(ng/mL) 為X軸，各膽汁酸扣除空白后的峰面積與內標峰面積之比為Y軸,進行線性回歸分析,得到15種膽汁酸的線性回歸方程和回歸系數。15種膽汁酸在儀器檢測范圍內呈良好的線性關系，線性范圍滿足臨床檢測需求，r2為0.993～0.999，均大于0.990,符合線性范圍驗證的要求。見表3。

表3 15種膽汁酸亞型擬合標準曲線和檢測線性范圍

2.3準確度及精密度 加標后測定3種濃度(低、中、高)的血清樣本15種膽汁酸亞型的平均加標回收率均滿足80%～120%，且Bias<15%，符合準確度評估要求；3種濃度的血清樣本15種亞型批內精密度和批間精密度的最大CV分別為13.26%和11.38%，均小于15%，滿足精密度評估要求。見表4。

表4 準確度及精密度(%)

續表4 準確度及精密度(%)

2.4攜帶污染率 15種膽汁酸亞型5次高值進樣后的空白殘留最大峰面積響應值為7 000，遠遠小于最低定量檢出限響應值的25%(16 000)，因此可認為該法不存在明顯的攜帶污染。

表5 健康孕婦孕中期15種膽汁酸亞型生物參考區間

3 討 論

近年來，膽汁酸各種亞型作為信號分子在孕期能量代謝中發揮的作用，成為代謝研究的熱點[11-13]。本研究基于LC-MS/MS技術建立一種簡單、快速測定膽汁酸譜的方法。用膽汁酸各種亞型標準品和對應氘代物建立標準曲線，以達到精準定量的目的。LC-MS/MS技術靈敏度高、特異性好，近年來已被用于總膽汁酸譜的臨床檢測。與之前報道的方法比較，LC-MS/MS技術在樣本前處理上使用了成本低廉的甲醇，且將蛋白沉淀渦旋后的離心時間延長為4 ℃下10 min，最大程度去除雜質。在保證檢測靈敏度的前提下，摒除了氮吹復融步驟，以減少操作誤差。為保證檢測體系的弱堿性，避免酸性物質的離子抑制作用，在流動相B中添加了5 mmol/L乙酸銨。由于15種膽汁酸各種亞型在水中的溶解度差異較大，并存在3組同分異構體，故對其梯度進行優化，降低了初始流動相中水相的比例，每一種同分異構體亞型都呈現出較好的分離效果。每份樣本15種膽汁酸亞型的檢測時長僅為9 min，極大提升了檢測效率。

鑒于長江中下游地區為孕期ICP高發地區[14]，南京市婦幼保健院為婦產科專科醫院，患者以孕產婦為主，不應直接套用健康人群參考區間。本研究建立了適合于本地區孕中期孕婦膽汁酸譜參考區間并通過驗證，有利于孕期不同肝膽疾病的鑒別診斷，指導臨床及時有效地對孕期肝膽疾病進行干預。

本研究具有一定的臨床應用價值，基于質譜技術建立的方法可以精準、快速地定量檢測膽汁酸譜，同時檢測膽汁酸譜中的15種亞型，有利于肝膽疾病的鑒別診斷。本研究建立了適合于本地區孕婦膽汁酸譜的參考區間，利用膽汁酸譜檢測結果可指導孕期肝膽疾病的診療。