帕布昔利布和氟維司群共載藥陽離子脂質體的制備和性質評價

李雙雙，呂佳琦，李 媛，趙玙璠，滕玉鷗，李明媛,2

(1.天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.天津市透明質酸應用研究企業重點實驗室，天津市康婷生物工程集團有限公司，天津300380)

乳腺癌是全球女性癌癥發病率最高的一種惡性腫瘤[1-3].目前，乳腺癌的治療方法主要有手術治療、放射治療、化學治療、內分泌治療、靶向治療及免疫治療等[4].其中，化學治療是治療乳腺癌常用的方法之一.由于單藥化療的使用有限，因此藥物聯合治療的方式在臨床上應用廣泛[5-9].

根據國家綜合癌癥網絡(national comprehensive cancer network，NCCN)的指南，帕布昔利布(palbociclib，Pal)和氟維司群(fulvestrant，Ful)組合被推薦為聯合治療乳腺癌的方案之一[10-11].帕布昔利布能夠選擇性地抑制細胞周期蛋白依賴性激酶 4和 6(cyclindependent kinase 4/6，CDK4/6)，是一種 CDK4/6抑制劑[12-14].它能恢復細胞周期控制，阻斷腫瘤細胞增殖，為美國 FDA批準的首個 CDK4/6抑制劑[15].氟維司群是一種純粹的雌激素受體(estro-gen receptor，ER)拮抗劑，沒有部分雌激素樣激動效應，通過結合、阻斷并下調 ER，從而抑制雌激素信號通路，能與 ER競爭性結合，與ER的親和力接近雌激素[16-17].

然而，臨床使用中的傳統組合只是一種簡單混合.由于藥物的理化性質、藥物代謝動力學性質的不同，簡單地將兩種藥物混合在一起使用具有局限性.為了克服這些局限性，將兩種藥物共同遞送到腫瘤細胞中至關重要.在納米載體中，脂質體[18-20]具有廣闊的應用前景.脂質體是一種具有緩釋作用的載體[21]，通過實體瘤的高通透性和滯留效應改善腫瘤組織中的藥物積累以及降低藥物對正常組織的毒性[22].此外，脂質體的內水相可以包封親水性藥物，脂溶性藥物則可包封于磷脂雙分子層間，使其可用于親水和疏水藥物的共同遞送.帕布昔利布的油水分配系數(logP)為 0.99，具有一定的親脂性和水溶性，可使用薄膜分散法將其包載于脂質體的磷脂雙分子層之間和內水相.氟維司群的 logP為 8.9，為脂溶性藥物，被脂質體包載時，可使用薄膜分散法被包載于脂質體的磷脂雙分子層之間.陽離子脂質體(cationic liposomes，CLs)是帶正電荷的近球形囊泡，主要由陽離子脂質組成，可有效地包載藥物.CLs因其表面帶有正電荷，可以與帶負電荷的細胞膜發生靜電作用，進而被細胞膜吸附，促進其被細胞攝取的能力，然后通過細胞內吞或者膜融合方式將藥物導入細胞而發揮作用.本研究旨在制備帕布昔利布和氟維司群共載藥陽離子脂質體(Pal-Ful-CLs)，通過陽離子脂質體共同遞送化學治療藥物帕布昔利布和氟維司群，以提高治療乳腺癌的療效.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

帕布昔利布(純度 99%，批號 HW20E1401-1)，北京華威銳科化工有限公司；氟維司群(純度≥99%，批號 G01S8Z42903)，上海源葉生物科技有限公司；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，批號 S03005)、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP，批號 001004)，艾偉拓(上海)醫藥科技有限公司；甲醇為色譜純，氯仿、二乙胺和磷酸為分析純，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純.

UV-2550 PC型紫外分光光度計，美國 Thermo Fisher Scientific公司；PB150Z-S型電子天平，島津國際貿易有限公司；RE-3000A型旋轉蒸發儀、SHI-Ⅲ型循環水式真空泵，上海亞榮生化儀器廠；SB-3200D型超聲波清洗儀、SCIENTZ-II D型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝科技有限公司；TGL-20M 型臺式冷凍離心機，湘儀離心機有限公司；1200型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Model 3100 series型CO2培養箱，賽默飛世爾科技公司；YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司；Nano-ZS90型粒度儀，英國Malvern公司.

1.2 帕布昔利布和氟維司群陽離子脂質體的制備

1.2.1 空白陽離子脂質體的制備

分別稱取 DOTAP與 DOPE(物質的量比 1∶3，質量分別為 6.98、22.32mg)混合磷脂于茄形瓶中，加入 3mL有機溶劑(氯仿、甲醇)溶解，37℃減壓旋蒸除去有機溶劑，茄形瓶瓶底形成蜂窩狀薄膜.常溫真空干燥后取下茄形瓶，向茄形瓶中加入2.93mL水化液(DEPC處理水)，50℃水化薄膜，制備為總磷脂質量濃度為 10mg/mL的陽離子脂質體.超聲使脂質體粒徑均勻，用 0.45μm、0.22μm 無菌濾膜過濾，得到空白脂質體，4℃保存.

1.2.2 載藥陽離子脂質體的制備

分別稱取 DOTAP與 DOPE(物質的量比 1∶3，質量分別為 6.98、22.32mg)混合磷脂、0.76mmol/L帕布昔利布 1mg、0.56mmol/L氟維司群 1mg于茄形瓶中，加入 3mL有機溶劑(氯仿、甲醇)溶解.按1.2.1節的薄膜分散法制得Pal-Ful-CLs，4℃保存.

1.3 帕布昔利布和氟維司群含量測定方法的建立

1.3.1 紫外吸收全波長掃描

分別稱取2mg Pal和2mg Ful標準品于2mL容量瓶中，加流動相定容，分別得 1mg/mL溶液；再稀釋至適宜濃度，過濾后待用.取適量樣品溶液于石英比色皿中，使用紫外分光光度計進行全波長掃描(波長 190～400nm)[23].

1.3.2 色譜分析與專屬性

帕布昔利布色譜條件：色譜柱 Eclipse XDBC18(4.6mm×150mm，5μm)，流動相為乙腈與水(含0.1% 三氟乙酸)，體積比為 25∶75，流量 1mL/min，柱溫30℃，檢測波長280nm，進樣量20μL.

氟維司群色譜條件：色譜柱 Eclipse XDBC18(4.6mm×150mm，5μm)，流動相為甲醇、乙腈和水(含 0.1% 三氟乙酸)，體積比為 70∶7.5∶22.5，流量 1mL/min，柱溫 30℃，檢測波長 220nm，進樣量20μL.

專屬性：分別稱取10mg帕布昔利布與氟維司群標準品于不同的 10mL容量瓶中，流動相定容、搖勻，分別得 1mg/mL帕布昔利布與氟維司群標準樣品儲備液，取儲備液分別依次稀釋定容至 30μg/mL作為對照品.移取空白脂質體破膜后作為空白脂質體供試品，移取 Pal-Ful-CLs破膜后作為共載藥脂質體供試品.在色譜條件下檢測樣品，分析色譜圖，記錄各樣品出峰保留時間.

1.3.3 破膜劑的選擇

破膜劑選擇能高效破膜且不會對藥物測定造成干擾的溶劑.傳統脂質體破膜常用甲醇、無水乙醇和5%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液.考察比較了甲醇、無水乙醇和5% SDS溶液破膜的效果.取2mL容量瓶9個，各加入 Pal-Ful-CLs 100μL，再依次加入甲醇、無水乙醇和 5% SDS溶液各 100、200、500μL，旋渦振蕩輔助破膜，待無丁達爾效應說明破膜完全.

1.3.4 線性及范圍

分別稱取 10mg帕布昔利布與氟維司群標準品于不同的 10mL容量瓶中，流動相定容、搖勻，得1mg/mL帕布昔利布與氟維司群標準樣品儲備液.取儲備液依次稀釋定容得 500、300、200、100、50、25、10μg/mL的系列標準溶液.在1.3.2節高效液相色譜條件下進樣，計算峰面積，繪制峰面積(y)與濃度(x)關系圖，得標準曲線.

1.3.5 重復性、精密度與回收率

重復性：分別稱取帕布昔利布與氟維司群標準品10mg于不同的 10mL容量瓶中，加流動相定容、搖勻，得 1mg/mL帕布昔利布與氟維司群標準樣品儲備液.將樣品溶液逐級稀釋，平行制得 50μg/mL兩種樣品溶液各6份.在1.3.2節高效液相色譜條件下檢測樣品，分析記錄峰面積，計算相對標準偏差RSD值.

精密度：分別稱取Pal和Ful標準品10mg于不同的 10mL容量瓶中，加流動相定容、搖勻，得1mg/mL帕布昔利布與氟維司群標準樣品儲備液.將樣品溶液逐級稀釋，各得 50μg/mL樣品溶液.在1.3.2節高效液相色譜條件下兩種樣品各連續進樣 6次分析.

回收率：分別精密量取 0.3、0.4、0.5mL Pal儲備液于 3個 10mL容量瓶中，接著加入處方比例的空白脂質體，再加500μL乙醇破壞脂質體結構，流動相稀釋定容，即為供試品.Ful供試品的制備同 Pal.將上述供試品在1.3.2節高效液相色譜條件下進樣分析.

1.3.6 樣品穩定性

取Pal-Ful-CLs破膜后于室溫下保存，按照1.3.2節色譜條件，于 0、1、2、4、6、8、10、12h 進樣測定，計算RSD值.

1.3.7 檢測限與定量限

分別稱取適量的 Pal和 Ful，用流動相進行倍比稀釋，從低濃度到高濃度依次進樣，在 1.3.2節色譜條件下測定樣品峰面積.當信噪比S/N為3時，進樣藥物濃度即為樣品檢測限；當信噪比 S/N為 10時，進樣藥物濃度即為樣品定量限.

1.4 帕布昔利布和氟維司群陽離子脂質體表征

1.4.1 包封率

分別取100μL Pal-Ful-CLs于2個2mL容量瓶中，一份加適量乙醇振蕩破壞脂質體結構，流動相定容，利用 1.3.2節高效液相檢測方法測定脂質體總藥濃度 Cy；另一份直接加去離子水稀釋定容，取其500μL置于截留相對分子質量為 3.0×104的超濾器離心管中，以離心力 11180g超濾離心 10min，收集下層濾液，利用 1.3.2節高效液相檢測方法測定超濾液中兩個游離藥物濃度 Cx.分別按式(1)和式(2)計算脂質體包封率和載藥量[24-25].

1.4.2 粒徑和電位

將脂質體用去離子水稀釋適當倍數后制得待測品，在比色皿中加入 1～1.5mL待測品，置于馬爾文粒度儀中，在(25±1)℃條件下利用動態光散射技術測定粒徑、多分散指數(PDI)和電位.每個樣品連續測量3次，計算平均值.

1.4.3 脂質體形態

將 Pal-Ful-CLs適當地稀釋后，在銅網上滴加20μL脂質體樣品，其中多余的液體用濾紙吸去并自然晾干，在風干處滴加磷鎢酸染3s，利用透射電子顯微鏡(TEM)掃描成像.

2 結果與分析

2.1 帕布昔利布和氟維司群含量測定方法學

2.1.1 紫外全波長掃描

Pal溶液和 Ful溶液紫外全波長掃描圖見圖1，280nm處為 Pal最大吸收峰，220nm處為 Ful最大吸收峰，故分別選擇280nm和220nm為Pal和Ful含量測定的紫外檢測波長.

圖1 Pal溶液和Ful溶液紫外全波長掃描圖Fig.1 Ultraviolet full-wavelength scan of Pal and Ful

2.1.2 破膜實驗

由于所制備的脂質體的粒徑小于入射光波長(400～700nm)，發生光的散射，這種光的散射現象就稱為丁達爾效應.當用一束光照射加入破膜劑后的體系時，出現光路則未破膜或未完全破膜.當 Pal-Ful-CLs中分別加入 100μL、200μL 和 500μL 破膜劑(甲醇、無水乙醇和 5% SDS)后，觀察到只有加入500μL無水乙醇后未出現光路，則說明破膜完全，故選擇每 100μL脂質體中加入 500μL無水乙醇進行破膜.

2.1.3 專屬性

專屬性實驗結果如圖2所示.

圖2 Pal和Ful專屬性實驗結果Fig.2 Specificity test results of Pal and Ful

Pal在9.8min左右出峰，Ful在10.3min左右出峰.在各自的液相條件下兩者均能完全分開，互無影響.同時，空白脂質體中的磷脂材料在 9.8min和10.3min左右均不出峰，對于測定無影響.

2.1.4 線性及范圍

Pal在 10～500μg/mL的范圍內線性良好，線性方程為 y＝57.864x＋66.972，R2＝0.9999，說明擬合度高，符合藥典要求.Ful在 10～500μg/mL的范圍內線性良好，線性方程為 y＝11.978x＋10.768，R2＝1，說明擬合度高，符合藥典要求.

2.1.5 重復性、精密度和回收率實驗

在精密度實驗中，同一樣品連續進樣 6次，Pal和Ful峰面積RSD均在2.0%范圍內，說明測定方法的精密度好，符合藥典要求；在重復性實驗中，重復進樣6次，Pal和Ful峰面積RSD均在2.0%范圍內，說明測定方法的重復性好，符合藥典要求；在回收率實驗中，Pal和 Ful的回收率均在 98.0%～102.0%的范圍內，且RSD均在2.0%范圍內，回收率良好.

2.1.6 樣品穩定性

測定 Pal-Ful-CLs破膜后 12h內峰面積，Pal和Ful的 RSD值分別為 1.83%和 1.73%，均在 2.0%范圍內，樣品穩定性良好.

2.1.7 檢測限與定量限

Pal檢測限為 25ng，定量限為 30ng；Ful檢測限為500ng，定量限為1μg.

2.2 脂質體性質評價

超濾離心法測得Pal和Ful脂質體的包封率分別為 31.20%和 100.00%.由于 Pal的 logP為 0.99，在0～3之間，具有脂溶性和水溶性，其與磷脂之間的相互作用弱，容易滲漏，導致包封率低.因此，在后續的實驗中，考慮制備較高濃度的脂質體，用以增加內水相體積所占比率，從而提高其包封率.而Ful的logP為 8.9，具有強親脂性，與磷脂具有強烈的相互作用，使脂質體不易滲漏，因此包封率高.圖3為陽離子脂質體的粒徑和電位分布圖.Pal-Ful-CLs的平均粒徑為(182.13±3.56)nm，多分散系數為0.18±0.02(小于0.2)，表明分散度良好.Pal-Ful-CLs的電位為(57.1±2.6)mV，陽離子脂質體表面的正電荷有利于脂質體在體系中的分散均勻和穩定.

圖3 脂質體的粒徑和Zeta電位分布Fig.3 Particle size and Zeta potential distribution of liosomes

2.3 TEM表征脂質體形態

通過透射電鏡觀察脂質體形態(圖4)可見，Pal-Ful-CLs呈圓形且均勻分散，粒徑與粒度儀所測一致.

圖4 Pal-Ful-CLs的透射電鏡圖Fig.4 TEM image of Pal-Ful-CLs morphological study

3 討 論

藥物的聯合使用已經在癌癥治療中引起了廣泛關注，耐藥性和腫瘤復發通常與基于單一藥物的癌癥化學療法相關.乳腺癌是發生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，屬于激素依賴性腫瘤.若患者 ER屬陽性，則可為患者實施內分泌輔助治療.Ful屬于新型雌激素受體下調劑，具有很好的臨床效果[26].內分泌療法的作用機制可能與抑制 CDK4/6的活性部分相關，CDK4/6活化可能導致內分泌治療耐藥，抑制CDK4/6活性的藥物與內分泌治療藥物聯用可能會起協同作用[27].因此，Ful和 Pal的聯合使用可以提高治療乳腺癌的療效.然而，通過將兩種藥物簡單混合的方法控制腫瘤細胞的藥物比例和劑量具有挑戰性.本研究制備了一種陽離子脂質體，能夠同時包載Ful和 Pal并共同遞送至腫瘤細胞，并對其性質進行了評估.

本研究首先使用紫外全波長掃描測定了 Pal和Ful的最大吸收峰，根據紫外全波長掃描圖選擇280nm和220nm為Pal和Ful含量測定的紫外檢測波長.在使用高效液相色譜法測定前，需要對脂質體進行破膜實驗，本研究分別用甲醇、無水乙醇和 5%SDS作為破膜劑，根據有無光路選擇以每 100μL脂質體中加入 500μL無水乙醇進行破膜.超濾離心法測得 Pal和 Ful脂質體的包封率分別為 31.20%和100.00%.由于 Pal的包封率較低，在后續的實驗中，考慮制備較高濃度的脂質體，用以增加內水相體積所占比率，用以提高其包封率.Pal-Ful-CLs的平均粒徑為(182.13±3.56)nm，多分散系數為 0.18±0.02，表明分散度良好；Pal-Ful-CLs的電位為(57.1±2.6)mV，使脂質體通過靜電斥力穩定分散，同時陽離子脂質體表面正電荷可以與帶負電荷的核酸藥物通過靜電吸附作用結合.因此，將化療藥物和核酸藥物進行同時包載用于癌癥治療是下一步實驗研究的重要內容.本研究制備的共載藥陽離子脂質體粒徑均一、分散穩定并且工藝重現性好，作為藥物共同遞送載體具有一定的應用前景.