CM-Dil標記對骨髓間充質干細胞的影響及其在大鼠陰道重建模型中的示蹤

張 寧，秦錫靜，朱玉林，李 珮，黃向華

(1.河北省石家莊市第四醫院生殖醫學中心，河北 石家莊 050011；2.湘雅常德醫院婦產科，湖南 常德 415000； 3.河北醫科大學第二醫院婦科，河北 石家莊 050000)

干細胞治療已成為近年來研究的熱點[1]，研究顯示干細胞移植能通過分化[2-3]或旁分泌功能[4-6]促進組織修復與再生。陰道缺失是由先天性或獲得性疾病引起的。陰道重建是解決這些患者性生活和性角色的主要方法[7-8]。本課題組的前期研究顯示：小腸黏膜下基質重建大鼠陰道后1個月陰道上皮再生，3個月才有較明顯的陰道平滑肌再生[9-10]，因此干細胞標記至少要維持3個月才能滿足研究的需要。氯甲基苯甲酰胺(chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine，CM-DiI)是一種比較穩定的親脂性羰花青膜熒光染料[7]，但膜熒光染料存在信號衰減現象，干細胞用CM-DiI標記后熒光信號的強度及持續時間是否適合均尚待研究。

1 材 料 與 方 法

1.1實驗動物及主要試劑 Sprague-Dawley大鼠(河北省實驗動物中心)，DMEM/F12 培養基(Hyclone)， 胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶溶液(0.25%Trypsin/1 mmol/L EDTA) (GIBICO)，L-谷氨酰胺(Sangon)，青霉素鈉和鏈霉素鈉(華北制藥)，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(Sigma)及CM-DiI( Molecular Probe) 。

1.2大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow stem cells，BMSCs)原代培養 頸椎脫臼法處死2～5周的Sprague-Dawley大鼠。 在75%的乙醇中浸泡5 min后，解剖分離出股骨和脛骨，并在無菌條件下仔細地清除黏附組織。用DMEM/F-12培養基(HyClone)沖洗骨髓腔并用200目尼龍濾器過濾去除較大組織后，將分離的骨髓細胞離心，沖洗，再離心，重懸后接種于25 cm2細胞培養瓶中，于37 ℃，5%CO2的培養箱中培養，72 h后更換培養基，此后每隔1 d更換一次。 細胞生長達到70%～80%匯合后，用0.25%胰蛋白酶/ EDTA(Gibco，賽默飛世爾)處理，收集細胞并用DMEM/F-12培養基傳代培養。收集第3代BMSCs備用。

1.3大鼠BMSCs的標記 將CM-DiI配制成濃度為1 mol/L的儲存液，用基礎培養基將儲存液稀釋成2.5 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L和20 μmol/L的標記液。3代BMSCs消化后離心，棄去上清液，PBS洗滌一次，計數細胞，根據細胞數添加適量的細胞標記液(1×106細胞∶1 mL細胞標記液)，移液器吹打充分混合后避光孵育，37 ℃ 5 min，4 ℃ 15 min，離心棄上清，PBS洗滌后再次離心，培養基重懸細胞，將玻片放置于24孔板底部，細胞懸液接種于24孔板中，24 h后取出玻片，PBS沖洗后甲醛固定DAPI染色，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4標記效率的計算 在熒光顯微鏡100倍視野下隨機選擇5個不重合的視野，計數細胞總數及未標記的細胞數，以計算標記效率：(細胞總數-未標記細胞數)/細胞總數×100%。

1.5細胞增殖能力檢測 將不同濃度標記后的細胞按5×104/mL的濃度，分別滴入7個96孔板，每孔100 μL，每板3個復孔，每板均設調零孔。接種24 h后更換培養基，此后每隔一天更換一次。接種后1～7 d每天取出一板測量，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，細胞培養箱中孵育4 h后取出，吸去上清液，每孔加入200 μL DMSO，室溫下微量振蕩器振蕩10 min。酶標儀檢測各孔吸光度OD值(λ=490 nm)，經調零孔校正后結果取平均值，繪制生長曲線。

1.6BMSCs與小腸黏膜下基質(small intestinal submucosa,SIS)復合 將前期實驗制備的SIS剪成2 cm×2 cm的正方形，預濕后置于12孔板中，3代BMSCs標記后以5×105個/cm2的濃度接種于SIS上，復合培養24 h后用于移植[10]。

1.7大鼠陰道重建動物模型的構建 體重200～250 g的成年雌性Sprague-Dawley大鼠用于陰道重建。1%戊巴比妥鈉(30～50 mg/kg)腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥位固定于手術臺上。在陰道黏膜下注入腎上腺素生理鹽水形成水墊，從陰道黏膜和會陰皮膚連接處剪開，牽拉陰道黏膜將陰道黏膜從陰道口向上分離至陰道穹處，切除整個陰道，術中避免尿道和直腸的損傷。將生理鹽水預濕的SIS包裹于模具上(自制陰道模具，長13 mm，外徑4 mm)再置入原陰道處，上端固定于宮頸處，下端縫合于陰道外口。術后大鼠分籠喂養，術后3 d內抗生素預防感染。術后14 d，1個月，3個月處死大鼠，取陰道組織做冰凍切片，熒光顯微鏡觀察。

1.8統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1大鼠BMSCs的形態學觀察 培養72 h后輕輕晃動培養瓶可見瓶底有散在分布的少量貼壁細胞，呈長梭型或多角形，第5天時形成細胞集落，貼壁細胞明顯增多，繼續培養至7～10 d細胞融合達80%以上。傳代后細胞生長加快，4～6 d即可傳代，至第3代細胞形態均一，呈漩渦狀或束狀生長(圖1)。

2.2CM-DiI標記大鼠BMSCs及標記率 CM-DiI標記后，干細胞胞膜發出橙黃色熒光，見圖2，各濃度的標記效率都可達98%以上，各組間差異無統計學意義(P>0.05)，但熒光強度隨濃度的增加而變強。

2.3不同標記濃度對干細胞增殖的影響 2.5 μmol/L及5 μmol/L標記后的生長曲線與對照組無明顯區別，10 μmol/L及20 μmol/L標記后生長曲線較對照組稍降低，見圖3。

圖3 大鼠BMSCs不同濃度CM-Dil標記后的生長曲線

2.4干細胞的示蹤 橙黃色的BMSCs在術后14 d，1個月，3個月的重建陰道組織中均可見到，隨時間延長熒光細胞數量減少，但不論任何時間段橙黃色的BMSCs均主要分布在重建陰道的深部，淺層及上皮中未見橙黃色的BMSCs。DAPI染色后高倍鏡下可見清晰的細胞結構，藍色的細胞核及周圍橙黃色的細胞膜，見圖4。

3 討 論

用于干細胞標記的方法比較多，常用的有以下幾種，①核酸標記：常用的有5-溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)和5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)，在細胞DNA合成過程中它們摻入到DNA序列里，應用相應抗體檢測被標記細胞。②Y染色體標記：將雄性供體細胞移植到雌性受體中，再使用相應的方法如PCR或原位雜交來檢測Y染色體長臂末端的特定重復序列，從而跟蹤這些細胞。③磁共振(magnetic resonance，MR)對比劑標記：細胞通過吞噬MR 對比劑[11](如超順磁氧化鐵顆粒)獲得標記，然后利用磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)追蹤細胞。④報告基因標記[12]：報告基因是一段DNA序列，整合到宿主細胞基因組中后表達相應蛋白以標記細胞。根據標記后檢測方法的不同報告基因又分為MRI報告基因：如鐵穩態蛋白；生物發光報告基因：如熒光素酶；熒光呈像報告基因：如綠色熒光蛋白等。⑤熒光染料標記：分為膜熒光染料和核熒光染料。膜熒光染料主要有CM-DiI、PKH26等，他們通過嵌入細胞膜內并側向擴散使細胞膜著色；核熒光染料主要有DAPI、Hoechst等，其染色原理是與細胞核內雙鏈DNA的AT堿基牢固結合，然后通過紫外光激發后發出熒光。

細胞標記理想的狀態是標記后不影響細胞的活性，對細胞無基因修飾，移植后可定量分析，移植細胞分裂后標記不減少，移植細胞死亡后標記不被吞噬，移植后數月甚至數年后仍可檢測。目前尚無一種方法能滿足這些要求，各種標記方法均有一定的局限性。核酸標記如brdu，可能被周圍細胞吞噬造成假陽性，而EdU除了假陽性影響外，有的學者認為它可能影響干細胞活性，不推薦其用于干細胞示標記。Y染色體標記的優勢在于移植前無需處理，可用于長期觀察，能夠應用實時定量RT-PCR檢測Y染色體性別決定區(SRY)基因觀測移植細胞的存活量[13], 但原位雜交顯示定植位置時操作比較復雜，并且只有切片正好通過Y染色體時才能顯示，可能造成假陰性結果，不太適合干細胞移植后定位及分化研究。磁共振對比劑標記的優勢在于可用于活體示蹤并對遷移路線進行確認，但是對設備要求比較高。報告基因標記通過轉染的方法把報告基因整合到宿主基因組中，雖然標記比較穩定，但操作復雜，轉染效率不穩定，不適合大量細胞的標記。熒光染料標記最突出的優點是操作簡單，熒光信號強。雖然隨著細胞的分裂熒光信號有衰減現象，但還是可以在一定時間段內檢測到熒光信號。文獻報道CM-dil標記的細胞可在1個月[14]，8周后被檢測到，甚至6個月后仍可檢測到熒光信號[15-16]。綜合比較各種標記方法后選用CM-DiI熒光染料進行標記。本研究顯示，各濃度的標記效率均可達98%以上，2.5 μmol/L及5 μmol/L標記后的生長曲線與對照組無明顯區別，10 μmol/L及20 μmol/L標記后生長曲線較對照組稍降低，因此5 μmol/L的標記濃度更適合用于干細胞標記。

陰道重建術是解決無陰道患者性生活和性角色的主要方法，目前常用的手術方法如腹膜代陰道[17]，結腸代陰道[18]均存在各種不足。近年來組織工程學蓬勃發展[19-20]，重建一個接近正常陰道形態和功能的陰道成為可能。干細胞復合小腸黏膜下基質重建陰道是否能促進重建陰道各個組織成分的再生，以及其機制尚不明了，這些研究都需要明確干細胞移植后的定位。本研究顯示標記后的干細胞與SIS復合后用于大鼠陰道重建，術后14 d、1個月、3個月重建陰道組織中均可見橙黃色的BMSCs，橙黃色的BMSCs主要分布在深層組織中，在術后3個月仍可見標記的干細胞，有助于研究干細胞向陰道平滑肌及神經的分化，能夠滿足陰道重建的基礎研究的需要。

綜上所述， 本研究顯示5 μmol/L的CM-DiI可能是BMSCs的最佳標記濃度，體內研究顯示干細胞至少能存活至移植后12周，為后期進一步研究干細胞對重建陰道的影響奠定了基礎。(本文圖見封三)