支氣管哮喘患者氣道炎癥與EOS的PI3K/Akt信號通路活化程度的關(guān)系研究

劉紅紅，邢寧寧，師麗敏，李愛軍

(河北省邢臺市第三醫(yī)院呼吸科，河北 邢臺 054000)

支氣管哮喘是由炎癥細胞介導的呼吸系統(tǒng)疾病，以氣道慢性炎癥、平滑肌紊亂以及氣道重塑為主要特征，其中氣道重塑是誘發(fā)患者發(fā)生氣道高反應性的重要因素，可引發(fā)肺心病、阻塞性肺氣腫等疾病[1]。嗜酸粒細胞(eosinnophil,EOS)是引發(fā)支氣管哮喘的重要炎癥細胞，氣道受到過敏原刺激可激活機體免疫系統(tǒng)，誘導EOS分泌大量的炎性介質(zhì)(如多種白細胞介素、趨化因子)，進而導致支氣管黏膜損傷、功能障礙等[2-3]。戴紹文等[4]通過實驗證實EOS參與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展，EOS的細胞功能活性與氣道炎癥因子分泌密切關(guān)聯(lián)。磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B(phosphatidylinositol kinase 3/Protein Kinase B,PI3K/Akt)信號通路在調(diào)控機體免疫、炎癥反應方面發(fā)揮重要作用，該通路的激活可誘導EOS的生長、增殖、遷移等生物學過程，特別是促進EOS的定向遷移[5]。聚集到氣道的EOS通過產(chǎn)生活性氧而介導蛋白質(zhì)和脂質(zhì)、DNA的異常生理功能，加劇了支氣管高反應性、炎癥反應[6]。目前關(guān)于支氣管哮喘患者氣道炎癥與EOS的PI3K/Akt信號通路的關(guān)系尚未明確，因此，本研究將通過分析臨床樣本進行論證，旨在探討EOS與支氣管哮喘患者氣道炎癥的相關(guān)機制，從而指導新藥開發(fā)。現(xiàn)報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2017年10月—2020年4月于我院就診的36例氣管哮喘患者作為觀察組，選取同時段于我院的36例健康體檢者為對照組。觀察組納入標準：①符合中華醫(yī)學會呼吸病學會制定的哮喘防治指南中的診斷標準[7]；②臨床表現(xiàn)：肺部可聞及哮鳴音，咳嗽、胸悶、發(fā)作性喘息；③病歷資料完整 。排除標準：①治療前1個月內(nèi)接受支氣管擴張劑、白三烯受體阻滯劑、糖皮質(zhì)激素治療；②心、肝、腎等重要臟器功能障礙；③重癥哮喘、感染和過敏性疾病；④妊娠期或哺乳期婦女；⑤精神意識障礙。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 基線資料比較Table 1 Comparison of baseline information (n=36)

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2方法

1.2.1病例資料收集 回顧分析所有患者病歷資料，包括性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙史、呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)體積濃度、血清總IgE水平、氣道重塑指標等信息，并對此次研究的病歷資料保密性負責。氣道重塑指：氣道壁面積占氣道總橫截面積百分比(WA%)=[π(D/2)2-π(L/2)2]/π(D/2)2×100%，支氣管管壁厚度與外徑比(T/D)，T=(D-L)/2，L、D分別為氣道內(nèi)、外徑。患者入組后均接受高分辨胸部CT掃描，選取中動脈弓和氣管分叉下1 cm、氣管分叉處上1 cm、右肺下靜脈和橫隔頂上 2 cm 處，采用電子標尺測量L、D以及T，均連續(xù)測量3次取均值。

1.2.2誘導痰細胞分布 患者吸入沙丁胺醇，10 min后用清水漱口以及高滲鹽水超聲霧化，深咳嗽并將痰液放置于培養(yǎng)皿中，收集密度大、黏稠度高的痰液，稱重后加入二硫蘇糖醇裂解，濾去雜質(zhì)，離心后PBS懸浮，采用臺盼蘭鑒定細胞活力。制作細胞涂片，多聚甲醛固定，染色、烘干、封片，光學顯微鏡下進行細胞(中性粒細胞、巨噬細胞、EOS)分類。

1.2.3PI3K/Akt信號通路蛋白表達檢測 采用Westblot印跡法檢測蛋白表達水平。收集誘導痰后，采用梯度離心法分離多形核白細胞。誘導痰在Ficoll-PaquePLUS淋巴分離液(芬蘭GE Healthcare)中分層，于室溫1 000 g離心30 min，通過EOS、紅細胞的低滲溶解分離多形核白細胞，并使用EOS分離試劑盒(美國MiltenyiBiotek)分離EOS。細胞液裂解分離后的EOS后，加入總蛋白提取液，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，10 000 r/min離心10 min，采用Bradford方法測定總蛋白濃度，將蛋白質(zhì)量濃度稀釋為5 mg/L。取20 μL蛋白液，變性后上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，隨后轉(zhuǎn)膜，加入兔抗人Akt、p-Akt、PI3K、β-actin一抗(1∶500)，辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)，采用化學底物發(fā)光法顯色。采用Image-Qua NT軟件測量顯色條帶的光密度，計算各組蛋白相對β-actin的表達量。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，采用Pearson分析EOS與各指標的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.12組誘導痰細胞分布情況 2組誘導痰中的細胞分布情況差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，觀察組EOS占比均明顯高于對照組，而中性粒細胞、巨噬細胞占比明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 觀察組、對照組誘導痰細胞分布情況比較Table 2 Comparison of distribution of induced sputum cells in observation group and control group

2.2EOS與氣道重塑指標、氣道炎癥標志物的關(guān)系 以觀察組患者EOS的均值為臨界值，將觀察組患者分為高EOS組和低EOS組，2組患者的FeNO體積濃度、血清總IgE、T/D、WA差異有統(tǒng)計學意義，其中高EOS組的FeNO體積濃度、血清總IgE、T/D、WA明顯高于低EOS組(P<0.05)，見表3。

表3 EOS與氣道重塑指標、氣道炎癥標志物的關(guān)系Table 3 Relationship between eosinophils and airway remodeling and airway inflammation markers

2.3EOS與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系 高EOS組和低EOS組的PI3K、p-Akt表達水平差異有統(tǒng)計學意義，其中高EOS組患者的PI3K、p-Akt表達水平明顯高于低EOS組(P<0.05)，見表4，圖1。

圖1 PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達情況

表4 EOS與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系Table 4 Relationship between eosinophils and PI3K/Akt signaling pathways

2.4氣道炎癥標志物與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系 Pearson分析顯示FeNO體積濃度、血清總IgE分別與PI3K、p-Akt具有正相關(guān)性(P<0.05)，見表5，圖2～5。

表5 氣道炎癥標志物與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系Table 5 Relationship between airway inflammatory markers and PI3K/Akt signaling pathways

圖2 FeNO與p-Akt的關(guān)系

圖3 FeNO與PI3K的關(guān)系

圖4 血清總IgE與p-Akt的關(guān)系

圖5 血清總IgE與PI3K的關(guān)系

3 討 論

支氣管哮喘以反復發(fā)作的咳嗽咳痰、胸悶氣喘等為主要臨床癥狀，反復發(fā)作可損傷氣道內(nèi)皮細胞，并誘導平滑肌細胞、細胞外基質(zhì)過度增殖，引起氣道狹窄，以及加重氣道高反應性和氣流受限，最終危及患者生命安全[8]。哮喘的發(fā)生涉及EOS、T細胞、肥大細胞等多種炎癥細胞，其中以EOS最具特征性，臨床研究發(fā)現(xiàn)隨著慢性持續(xù)期患者病情的加重，誘導痰EOS呈增加趨勢，表明EOS與哮喘病情嚴重程度存在相關(guān)性，通過開展誘導痰細胞學檢查可客觀反映炎癥、氣道狀態(tài)，以及早期評估病情變化[9]。EOS來源于骨髓CD34+祖細胞，參與多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展，如在過敏性鼻炎中EOS通過分泌嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、酸性粒細胞過氧化物、主要堿性蛋白、嗜酸性粒細胞神經(jīng)毒素等顆粒蛋白而參與炎癥反應，如誘導炎性細胞的黏附聚集、刺激炎性因子的分泌等[10]。EOS的血管內(nèi)皮遷移涉及滾動、牢固黏附、跨內(nèi)皮遷移等過程，主要由黏附分子、趨化因子、細胞因子間的網(wǎng)絡調(diào)控細胞進行調(diào)節(jié)，其中PI3K/Akt信號通路可誘導炎癥細胞以及炎癥介質(zhì)的形成和釋放，從而引發(fā)氣道變應性疾病(支氣管哮喘、過敏性鼻炎等)[11]。研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt信號通路后，EOS的脫顆粒蛋白、增殖、遷移等過程受到抑制，表明PI3K/Akt信號通路在調(diào)控EOS的生物學功能方面發(fā)揮重要作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組、對照組誘導痰中的細胞分布(EOS、中性粒細胞、巨噬細胞)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中觀察組患者EOS占比明顯高于對照組，與既往研究結(jié)果一致[13]，表明支氣管哮喘患者中氣道炎癥表型以EOS為主，占比高達50%，可通過痰液中EOS的計數(shù)評估氣道炎癥和區(qū)分炎癥表型。EOS在過敏性氣道炎癥過程中的趨化性可反映炎癥進程，如過敏原激發(fā)試驗顯示支氣管哮喘患者血液中EOS對化學物質(zhì)具有更強的反應性，誘導物可增強EOS的趨化性，并刺激釋放毒性顆粒蛋白，引起氣道組織活性氧損傷[14]。FeNO、血清總IgE均是氣道炎癥標志物[13]，其中FeNO可評估患者哮喘炎癥程度和疾病控制水平，以及反映肺功能狀態(tài)，IgE是機體受到免疫原刺激后產(chǎn)生的特異性免疫球蛋白，可增加EOS、肥大細胞的敏感性，刺激炎癥因子分泌，從而加重支氣管哮喘的氣道炎癥反應。本研究表明觀察組患者的氣道炎癥標志物(FeNO體積濃度、血清總IgE)水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且進一步分析發(fā)現(xiàn)隨著EOS比例增加，血清總IgE、FeNO體積濃度呈增加趨勢，表明EOS比例與炎癥標志物存在相關(guān)性。另外，觀察組患者的T/D、WA均明顯高于對照組，與蔣凌志等[15]研究結(jié)果一致，氣道重塑是引起支氣管哮喘持續(xù)惡化的病理基礎，可導致肺纖維化和肺功能降低。高EOS組的T/D、WA均明顯高于低EOS組，分析認為EOS誘導的氣道炎癥反應可損傷氣道內(nèi)皮組織，刺激平滑肌細胞、杯狀細胞的增生，降低氣道痙攣可逆性，進而增加氣道高反應性及氣流受限程度，故而導致氣道重塑。

PI3K/Akt 信號通路可調(diào)控多種免疫細胞(EOS、肥大細胞、T 淋巴細胞等)的分化、活化，進而參與氣道變應性疾病的病理生理過程。本研究顯示，高EOS組的PI3K、p-Akt表達水平明顯高于低EOS組，進一步證實PI3K/Akt信號通路的活化與EOS的增殖、遷移密切關(guān)聯(lián)。包海鵬等[16]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 信號通路通過調(diào)節(jié)下游p-Akt的表達而調(diào)節(jié)EOS的生物學過程，EOS通過Eotaxin(可刺激EOS的趨化性)處理可激活PI3K/Akt 途徑，促進EOS的增殖、遷移和脫顆粒蛋白的表達，進而誘發(fā)氣道炎癥反應。同時本次研究通過Person相關(guān)性分析顯示FeNO體積濃度、血清總IgE與PI3K、p-Akt具有正相關(guān)性，進一步證實支氣管哮喘患者氣道炎癥與EOS的PI3K/Akt信號通路活化程度具有相關(guān)性。Huang等[17]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者氣道周圍浸潤著大量的炎癥細胞，阻斷PI3K/Akt信號通路后可阻斷炎癥細胞浸潤，降低炎癥因子的表達(纖維連接蛋白1、I型膠原等)，以及增加黏鈣蛋白的表達，從而阻斷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而減輕哮喘患者氣道重塑過程。PI3K信號通路還可以通過刺激氣道平滑肌細胞的增殖以及調(diào)控氣道平滑肌細胞的生長周期而加重支氣管哮喘氣道炎癥反應，另外，哮喘動物模型實驗以及支氣管哮喘患者的臨床觀察均能發(fā)現(xiàn)PI3K信號通路的異常活化，且通過PI3K抑制劑處理后可明顯抑制支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展，進一步表明PI3K/Akt信號通路與支氣管哮喘的炎癥、氣道重塑等病理過程密切關(guān)聯(lián)。

綜上所述，支氣管哮喘患者的EOS的PI3K/Akt信號通路處于活化狀態(tài)，與氣道炎癥(FeNO、血清IgE)具有正相關(guān)性。