CRIP1基因在人卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義

劉 陽，康 林，鄭國娜，趙煥芬

(河北省人民醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050051)

卵巢癌(ovarian cancer)每年大約新增240 000例患者，世界上第七常見的女性癌癥，全球女性死亡最常見原因之一，探索卵巢癌發(fā)病機制、診斷標(biāo)記物、潛在治療靶點、預(yù)后相關(guān)指標(biāo)已成為熱門研究領(lǐng)域。盡管卵巢癌的診斷和治療有了顯著的改善，但許多患者的預(yù)后仍然很差，特別是晚期卵巢癌患者。為解決這一難題，研究者們試圖尋找生物標(biāo)記物來輔助卵巢癌的臨床診斷和預(yù)后評價[1-3]。富含半胱氨酸腸蛋白1(cysteine-rich intestinal protein 1，CRIP1)是相對分子質(zhì)量為8 000的小分子蛋白[4]。近年來已有文獻(xiàn)報道其在多種類型腫瘤中過表達(dá)，包括甲狀腺癌[5]、結(jié)直腸癌[6-7]、宮頸癌[8]等，并對疾病的預(yù)后有重要的影響，然而在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用至今尚不清楚，也未曾有文獻(xiàn)報道，因此本研究通過采用生物信息學(xué)方法探究CRIP1在卵巢癌中表達(dá)水平、與患者預(yù)后關(guān)系以及相關(guān)生物學(xué)功能，建議CRIP1成為卵巢癌診治的重要靶點和預(yù)后判斷的關(guān)鍵指標(biāo)。

1 資 料 與 方 法

1.1CRIP1基因在各類癌癥中的表達(dá)水平 使用Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www. oncomine.org/)分析CRIP1基因在不同類型癌癥研究中的表達(dá)水平以及在不同病理分型的卵巢癌中的表達(dá)分布。篩選條件：①Gene，CRIP1；②Analysis type，Cancer vs Normal analysis；③P-value，0.05；④Fold change，1.5；⑤Gene rank，All；⑥D(zhuǎn)ate type，Mrna。

1.2CRIP1表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后關(guān)系 運用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)分析高表達(dá)CRIP1的卵巢癌患者和低表達(dá)CRIP1的卵巢癌患者總生存期、無進(jìn)展生存期、進(jìn)展后生存期的關(guān)系，篩選條件：①Spite patients by：auto select best cutoff；②Follow up threshold：all；③Probe set options：user selected probe set；④Survival：overall survival/progression-free survival/post pro-gression survival。根據(jù)臨床特征，包括不同腫瘤分期、腫瘤分級、不同化療藥方案對卵巢癌患者進(jìn)行分組，分析CRIP1基因表達(dá)與卵巢癌患者總生存期的關(guān)系。

1.3分析卵巢癌中CRIP1相互作用功能蛋白 使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)11.0版本在人類物種中檢索目的基因CRIP1，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI network)，并且基于關(guān)鍵蛋白節(jié)點進(jìn)行Go-Biological Process分析。篩選條件：①protein name：CRIP1；②organism： Homo sapiens。

1.4分析卵巢癌中與CRIP1緊密相關(guān)蛋白 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)分析CRIP1與緊密相關(guān)蛋白的P值和Pearson相關(guān)系數(shù)。篩選條件：①Gene A,CRIP1；②Gene B,相關(guān)蛋白；③Correlation Coefficient,Pearson；④Used Expression Datasets,TCGA Tumor，Ovarian serous cystadenocarcinoma。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析CRIP1基因的表達(dá)水平，比較采用獨立樣本t檢驗;Kaplan-Meier Plotter分析CRIP1基因表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后關(guān)系，采用Log-rank檢驗比較其高表達(dá)和低表達(dá)的卵巢癌患者生存差異; GEPIA數(shù)據(jù)庫分析Pearson相關(guān)系數(shù)，篩選與CRIP1具有正、負(fù)相關(guān)性的功能蛋白。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CRIP1基因在多種類型腫瘤中差異性表達(dá) 在卵巢癌中高表達(dá) Oncomine數(shù)據(jù)庫收集到337項CRIP1基因與腫瘤相關(guān)研究，166項研究中腫瘤組織與正常組織的CRIP1 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中有102項研究中CRIP1在腫瘤組織中表達(dá)呈現(xiàn)升高水平，包括乳腺癌(24項)、腎癌(8項)、淋巴瘤(12項)、白血病(8項)以及卵巢癌(6項)等。64項研究中CRIP1在腫瘤組織中表達(dá)呈現(xiàn)下降水平，包括結(jié)直腸癌(9項)、頭頸癌(8項)、腎癌(6項)、以及肺癌(15項)等，其中在卵巢癌的研究中CRIP1 mRNA在癌組織中均過表達(dá)分布，未發(fā)現(xiàn)有表達(dá)下調(diào)的研究(圖1)。在卵巢癌不同病理分型的6項研究中，CRIP1在各類卵巢癌中的表達(dá)水平均高于正常卵巢組織(差異倍數(shù)>1.5)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同分型卵巢癌與正常卵巢組織間CRIP1表達(dá) 顯著性變化Table 1 The significant changes of CRIP1 expression between different types of ovarian cancer and normal ovary tissue

圖1 CRIP1基因在不同類型腫瘤中表達(dá)水平

2.2CRIP1高表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后較差 運用Kaplan-Meier Plotter分析CRIP1基因表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的相關(guān)性，包括卵巢癌患者10年總生存期、無進(jìn)展生存期以及進(jìn)展后生存期3個指標(biāo)。總生存期關(guān)系：CRIP1高表達(dá)組卵巢癌患者總生存期顯著低于低表達(dá)組卵巢癌患者(P<0.05；HR=1.14)；無進(jìn)展生存期關(guān)系：CRIP1低表達(dá)組卵巢癌患者無進(jìn)展生存期顯著高于高表達(dá)組患者(P<0.05；HR=1.19)；進(jìn)展后生存期關(guān)系：CRIP1低表達(dá)組和高表達(dá)組卵巢癌患者進(jìn)展后生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；HR=0.86)，以上數(shù)據(jù)預(yù)示CRIP1基因可作為卵巢癌預(yù)后診斷標(biāo)記物(圖2)。接下來根據(jù)臨床特征分析CRIP1基因表達(dá)與卵巢癌患者總生存期的關(guān)系，把卵巢癌患者按照不同腫瘤分期和腫瘤分級進(jìn)行分組，并未發(fā)現(xiàn)CRIP1高表達(dá)組和低表達(dá)組患者總生存期在不同階段存在顯著差異。然而按照卵巢癌患者接受不同的化療方案進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)使用紫杉醇、多西他賽、拓?fù)涮婵祷熕幍幕颊咧校珻RIP1高表達(dá)組總生存期顯著低于低表達(dá)組(P<0.01，HR=1.88；P<0.05，HR=1.75；P<0.05，HR=1.57)，說明CRIP1高表達(dá)的卵巢癌患者接受上述3種化療方案后預(yù)后較差，見表2。

表2 根據(jù)臨床特征分析CRIP1高表達(dá)與 低表達(dá)組卵巢癌患者總生存期關(guān)系Table 2 The analysis of overall survival of ovarian cancer patients with high or low expression of CRIP1 according to the clinical characteristics

圖2 CRIP1基因高表達(dá)和低表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后關(guān)系

2.3探索CRIP1相互作用的功能蛋白，并進(jìn)行GO分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測到CRIP1蛋白與20個功能蛋白有相互作用，構(gòu)建蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)LMO1、LMO2、LMO3、PQLC3、CBFB、DBI、LGALS3、YAP1、STK3、STK4、CEBPE、CAPG、LIMS2、NME1、TAGLN2、ATOX1、KBTBD11、FGD2、ANKLE1、DSTN與CRIP1蛋白相互作用。進(jìn)一步使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析，獲得4個功能蛋白在卵巢漿液性囊腺癌中與CRIP1蛋白關(guān)系更為密切，其中與STK4(r=-0.24，P<0.001)和YAP1(r=-0.24，P<0.001)呈負(fù)相關(guān)，與LGALS3(r=0.23，P<0.001)和ATOX1(r=0.22，P<0.001)呈正相關(guān)(圖3)；基于相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，進(jìn)行CRIP1蛋白生物過程Go分析，發(fā)現(xiàn)CRIP1蛋白參與造血干細(xì)胞分化的調(diào)控、調(diào)節(jié)造血功能、Hippo信號通路、發(fā)育過程調(diào)節(jié)、胚胎細(xì)胞分化調(diào)節(jié)、凋亡信號通路調(diào)節(jié)、造血功能調(diào)節(jié)、脂肪細(xì)胞分化調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，見表3。

表3 CRIP1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的生物過程Go分析Table 3 Gobiological process of CRIP1-interacting protein network

圖3 與CRIP1相互作用的功能蛋白

3 討 論

富含半胱氨酸腸蛋白(cysteine-rich intestinal protein，CRIP)屬于LIM(Lin-1，Isl1，Mec3)蛋白家族的一個亞家族，因富含9%的半胱氨酸而得名。CRIP家族成員包括CRIP1、CRIP2和CRIP3。CRIP1廣泛分布在人體中，如小腸、結(jié)腸、肺、胸腺、脾等，也可通過鋅、細(xì)胞因子和激素體外誘導(dǎo)，在真核細(xì)胞的生長發(fā)育以及分化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[4]。CRIP1基因在腫瘤方面的研究較為熱門，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人類宮頸癌、胰腺癌、甲狀腺癌等腫瘤中高表達(dá)分布[9-10]。有文章指出，CRIP1在甲狀腺癌中高表達(dá)，并且在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲過程中扮演致癌基因的角色[5]。有研究證明，CRIP1基因異常表達(dá)與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移程度有關(guān)，沉默CRIP1基因能有效抑制腫瘤的遷移和侵襲，有助于結(jié)腸癌預(yù)后和轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物的開發(fā)[7]。研究報道了CRIP1在人類宮頸癌進(jìn)展中的作用，發(fā)現(xiàn)CRIP1在宮頸癌細(xì)胞系中高表達(dá)，通過介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，激活Wnt /β-連環(huán)蛋白信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[8]。以上研究說明CRIP1在多種類型腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用，有望成為腫瘤治療的新靶點，但是至今并沒有文章報道CRIP1在人類卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中起到怎樣的作用？因此本研究通過采用生物信息學(xué)方法探究CRIP1在卵巢癌中表達(dá)水平、與患者生存期的關(guān)系以及相關(guān)生物學(xué)功能。

研究發(fā)現(xiàn)CRIP1在不同類型的腫瘤中差異性表達(dá)，102項研究中腫瘤表達(dá)呈顯著上升水平，64項研究其表達(dá)呈顯著下降水平，但是在6項卵巢癌研究中其腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于正常卵巢組織，并且在不同病理分型的卵巢癌中，如卵巢漿液性腺癌(卵巢漿液性囊腺癌、卵巢漿液性乳頭狀癌)、卵巢黏液腺癌中均高表達(dá)分布，預(yù)示著CRIP1過表達(dá)水平對卵巢癌發(fā)生發(fā)展會有重要作用。接下來分析CRIP1基因與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，CRIP1基因高表達(dá)的卵巢癌患者總生存期和無進(jìn)展生存期均顯著降低；根據(jù)不同的臨床特征進(jìn)行分組，CRIP1表達(dá)雖與不同分期和不同分級的卵巢癌患者總生存期無密切相關(guān)性，但是CRIP1高表達(dá)的患者在接受紫杉醇、多西他賽、拓?fù)涮婵祷熀罂偵嫫陲@著降低，說明CRIP1高表達(dá)的患者應(yīng)合理選擇化療方案，規(guī)避風(fēng)險，說明CRIP1基因高表達(dá)是卵巢癌預(yù)后的危險因素，提示CRIP1作為預(yù)后分子診斷標(biāo)志物具有一定的應(yīng)用前景。為了更好的了解CRIP1蛋白的作用機制以及與其他蛋白的功能聯(lián)系，進(jìn)一步通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建CRIP1相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測20個功能蛋白與CRIP1相互作用，進(jìn)一步GEPIA數(shù)據(jù)庫分析獲得4個緊密相關(guān)蛋白，通過查閱文獻(xiàn)均在卵巢癌中發(fā)揮作用：STK4，壓力激活的、促凋亡的激酶，是Hippo信號通路的關(guān)鍵成分，STK4/Hippo信號的異常或者缺失會導(dǎo)致機體發(fā)育障礙、致癌作用、癌癥預(yù)后較差等[11-12]；YAP1，作為Hippo信號通路的效應(yīng)因子，在許多癌癥中Yap1的動態(tài)表達(dá)會導(dǎo)致表型改變，在肝癌、胃癌、卵巢癌等多種癌癥類型中過表達(dá)的Yap1被認(rèn)為是不良預(yù)后標(biāo)志物[13-14]；LGALS3，參與多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞凋亡、先天免疫、細(xì)胞黏附和T細(xì)胞調(diào)節(jié)等，在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，與患者預(yù)后緊密相關(guān)[15-16]；ATOX1，作為抗超氧化物和過氧化氫的抗氧化劑，可能在癌癥的發(fā)生中產(chǎn)生重要作用。基于CRIP1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，進(jìn)行Go聚類分析發(fā)現(xiàn)CRIP1蛋白參與造血干細(xì)胞分化、造血功能、Hippo信號通路以及發(fā)育調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，以上分析提供了CRIP1在卵巢癌中可能的作用機制，明確的機制還需要進(jìn)一步實驗研究。

本研究通過生物信息學(xué)方法和大數(shù)據(jù)分析從不同層面揭示了CRIP1在卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義，研究證明CRIP1高表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后負(fù)相關(guān)，提示CRIP1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演致癌基因的角色，有望成為卵巢癌診治的重要靶點和預(yù)后判斷的關(guān)鍵指標(biāo)。