羅源灣細菌多樣性調查及其環境影響因子分析

朱 琳

(福建省漁業資源監測中心，福建 福州 350003)

海洋細菌多樣性，狹義范圍包括遺傳物質多樣性、種群結構多樣性、生理性狀多樣性和生態功能多樣性，廣義范圍上還包括化學多樣性、代謝多樣性及其生存環境多樣性[1]。海洋細菌種類繁多，數量龐大，無時無刻不在參與著海洋物質如氮、碳、磷、硫的循環[2]，能有效地降解石油類污染物[3]、結合海水中高濃度CO2[4]、參與營養能量循環，代謝產物又為其他生物提供了生存環境，海洋細菌為海洋生態系統的功能穩定和能量循環、海洋生物的生存代謝作出了巨大的貢獻。環境科學家通過對細菌多樣性的研究，探討環境對細菌菌群結構的影響，以此還原生態多樣性、維持生物相互關系、修復海洋環境。

羅源灣是福建省六大深水港灣之一，位于福建省東北部，是典型的半封閉海灣，只在東北角由可門與東?；ネ╗5]。2009—2014年間羅源灣水質出現持續惡化，無機氮和活性磷酸鹽超標，主要原因是羅源灣前期大規模的圍填海、臨港工業項目和海水養殖的密集發展。2015年養殖業開始大量清退，但隨著經濟的發展和清退工作的開展，羅源灣的產業結構向火電能源、鋼鐵冶煉、港口物流和船舶修造等重工業方面轉變[6]。2018年11月羅源灣水域富營養化指數為2.04[7]，較之前有明顯好轉，但水質仍未達標，無機氮和活性磷酸鹽含量持續超標，主要原因是陸源性污染沒有得到很好的控制，大量的圍填海工程導致海灣納潮量下降，降低了海灣的自凈能力，另外養殖藻類的清退[8]也是海水富營養化的客觀原因之一。

宏基因組學是以環境樣品中的微生物群體為研究對象，直接從中篩選或分析目標基因功能、遺傳信息組成、群落結構功能和種群相互關系等的研究方法[9]。宏基因組研究避免了傳統微生物學中靠純培養來篩選菌株的局限，可以從更高、更復雜的層面了解基因資源，認識生物的多樣性，描繪完整的群落結構。本文主要運用宏基因組技術對福建羅源灣內細菌多樣性進行分析，了解海灣內的細菌分布情況，結合環境數據分析環境因子對細菌的影響，探索可能影響細菌多樣性的環境因子，為羅源灣海灣細菌多樣性、基因功能和生態結構提供數據基礎，為保護海洋生態系統平衡提供科學依據，以及為保護和改善羅源灣海洋環境奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 站位布設

為了解福建羅源灣海水中的微生物生態系統平衡變化，以及海灣內細菌多樣性、菌群結構及環境對細菌分布的影響，于2018年11月對羅源灣進行表層海水采集。根據功能劃分設置站位，生活密集地區設置A號站位(26.4170°N、119.6943°E)，主要排污口設置B號站位(26.4582°N、119.6810°E)，火電站排污口設置C號站位(26.3853°N、119.7127°E)，灣內遠離污染口設置D號站位(26.4374°N、119.7611°E)，出?？谠O置E號站位(26.43512°N、119.8294°E)，共5個站位(圖1)。表層水樣的采集方法按照GB 17378.3—2007標準要求執行，每個站點采水器深入海面0.5 m采集海水樣品，每個海水樣品取3個平行樣各3 L，并測定相關環境因子。

1.2 樣品的采集與前處理

對福建羅源灣內5個站位進行表層水樣采集，出發前所有器皿需消毒殺菌，準備穩定劑。采樣過程中，每個站位采水樣之前都要清洗采水器，確保不出現樣品互相污染。每次采集到的水樣裝入提前滅好菌的無菌樣品袋中混勻，分別編號A、B、C、D、E(與站位號一一對應)，4℃保存，24 h內進行微生物試驗。

1.3 基本方法

1.3.1 總DNA的提取及測序分析

取距海面0.5 m的表層海水通過0.22 μm微孔濾膜抽濾，將密布菌體的一面向內對折后放置在無菌處理后的50 mL離心管中，-40℃保存。在生物安全柜中，無菌條件下將采集的濾膜樣品剪碎，按照廠家提供的DNA提取試劑盒的步驟說明進行DNA提取。將提取好的總DNA，-40℃保存送至上海奧維森科技公司進行MiSeq PE300測序及分析。

1.3.2 環境因子的測定

按照GB 17378.4—2007標準中的方法進行環境因子的測定?，F場取樣并測定水溫及鹽度；用磷鉬藍分光光度法測定無機磷；用硅鉬黃法測定活性硅酸鹽；用萘乙二胺分光光度法測定亞硝酸鹽；用鋅鎘還原法測定硝酸鹽；用次溴酸鹽氧化法測定氨-氮；用紫外分光光度法測定油類；用多管發酵法測定糞大腸菌群。

1.3.3 樣品多樣性分析

1)OTU基礎分析

提取樣品的總基因組DNA，按指定測序區域，合成帶有barcode的特異性引物或合成帶有錯位堿基的融合引物，利用PCR擴增進行文庫模板的富集[10]。MiSeq測序得出的雙端序列，進行過濾處理后拼接成一條序列，去除嵌合體和長度較小的tags。在生物遺傳學研究中，對樣品測序結果的序列進行分類，相似度達到97%的進行歸類操作，劃分為一個小組，這個小組就定義為一個OTU，每個OTU對應一條不同的16S rRNA序列，也就是一個OTU對應一個細菌種。

2)Alpha(α-)多樣性

α-多樣性指數用于測量和度衡群落的物種多樣性，通過對單個樣品的α-多樣性分析，可以反映一個特定區域或生態系統內的多樣性，并可用統計學指數估算物種豐富度和多樣性。主要因素有兩個：一個是Chao1稱作菌種豐富度指數，用來估算群落中的OTU值，Chao1值越大，菌種越豐富；一個是Shannon，用來估算樣品中細菌多樣性的指數之一，Shannon值越大，說明菌群多樣性越高。

3)Beta(β-)多樣性

3)提出了風速、降雨量、液態水含量超短期預測方法，并以風速、降雨量、液態水含量預測值為基礎提出了超短期覆冰趨勢預測方法；

β-多樣性用于測度群落的物種多樣性沿著環境梯度變化的速率或群落間的多樣性，即組間差異，可用來表示樣本之間的距離。

4)質量控制與質量保障

為了保證實驗真實性和數據可靠性，在樣品采集、實驗操作和數據分析的過程中遵循以下原則：樣品的采集前后，都應多次清洗采水器以保證采水器不被前一個樣品污染；盛裝樣品的容器要滅菌消毒后使用；所有的環境因子測定過程中，均設置平行樣及空白樣；結果需用儀器測定的要在同一臺儀器設備上完成，儀器設備使用之前都要進行檢定或校準；實驗中用到的藥品試劑要嚴格遵循生產日期及有效期，使用前校驗純度，避免因為試劑過期變質引起結果誤差。

2 結果與分析

2.1 OTU分析結果

MiSeq得到的測序結果經過一系列操作過濾尾部過短堿基序列、把剩下的序列拼接成一條序列，去除嵌合體和短序列后，得到優質序列，優質序列分布在400～440之間(表1)。序列分布說明數據處理合理有效。

表1 優質序列分布統計

對DNA相似性≥97%的序列分析，共產生了2 035個OTU，樣品的OUT數目見表2。其中A站位生活密集地區采集到的樣品編號為A，OTU數目為999；B站位主要排污口采集到的樣品編號為B，OTU數目為1 004；C站位火電站排污口采集到的樣品編號為C，OTU數目為775；D站位在遠離污染口的灣內，采集樣品編號為D，OTU數目為977；E站位位于可門口與東海相連的出海口，采集到的樣品編號為E，OTU數目為807。羅源灣灣內各站位OTU數目從大到小的樣品編號依次為B>A>D>E>C，說明B站位OTU數目最多，可能與排污口排放污水有關；A站位OTU數目較多，可能與生活區污水排放引起水體富營養化有關；D站位在灣內，雖然遠離污染口，但灣內水體富營養化影響了整個海灣，直接造成了D的OTU值僅次于A站位；C站位靠近可門電廠，工業廢水的排放可能含有油類，對OTU值有負影響；E站位在出海口，但是離C站位比較近，可能油類的影響無法忽視。

表2 單個樣本的OTU數目統計

樣品稀釋曲線趨勢平坦(圖2)，說明數據量合理，增加數據量對產生新的OTU影響不大。對各樣品的OTU進行Venn圖分析(圖3)，生活區樣品獨有的OTUs數有91個，排污口樣品獨有的OTUs 64個，火電站樣品獨有的OTUs 51個，灣內樣品獨有的OTUs 27個，出?？跇悠藩氂械腛TUs 32個。數據表明遠離污染物的D、E水樣中特征菌種比較單純、受環境影響較少，生活區水樣中特有菌種最多，表明水體富營養化使細菌大量富集，而且變異產生新的菌種。

2.2 Alpha多樣性分析

通過單個樣品的α-多樣性分析，可以對規定區域內或特定生態系統中的細菌多樣性進行了解分析，客觀反映菌種的豐富度和細菌多樣性。5個站位細菌群落通過α-多樣性分析各項指數(表3)，覆蓋率均大于99%，說明能客觀真實地反映羅源灣的細菌群落信息。B站位水樣中的Chao1和Shannon指數均大于其他樣品，C站位的水樣中Shanno值最低，D、E站位水樣中的Chao1和Shannon指數明顯低于A、B樣品。說明主要排污口因排放生活污水等，導致水質富營養化較明顯，細菌多樣性最豐富；生活密集區的人類活動造成的陸源污染對水質造成的污染不容忽視；電廠污水排放口細菌復雜程度變化不明顯；D、E兩點為遠離污染的區域，環境因子對細菌多樣性影響不大，群落相對單純；C站位Shannon值最低，說明群落多樣性最小，該站位水質環境因子對細菌群落多樣性有負影響。

表3 羅源灣細菌α-多樣性分析指數

2.3 Beta多樣性分析

對羅源灣內5個站位的海水樣品運用PCA方差分解，將15組數據的差異反映在坐標圖上，如果樣本組成越相似，在PCA圖中距離越近，以此分析組間和組內差異大小。對5個站位的樣品進行聚類分析(圖4)，同個樣品的3個平行樣較聚集，說明組內細菌成分較一致，A、B站位出現重合，說明兩個站位內，受環境因子影響相似，細菌群落種類相似；D、E站位遠離A、B站位，D、E與污染區距離較遠，細菌群落較單純。

2.4 物種注釋

對羅源灣5個站位的海水樣品按照門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)分類水平進行物種分類統計。

選取門水平中最大豐度排名前20的物種，以樣品編號為橫坐標，物種豐度為縱坐標，繪制相對物種豐度柱狀圖(圖5)。對比門水平(Phylum)的物種豐度圖，得到羅源灣海水中微生物數目前5的優勢門分別為變形菌門(Proteobacteria)，相對物種豐度為72.00%；擬桿菌門(Bacteroides)，相對物種豐度為11.28%；放線菌門(Actinobacteria)，相對物種豐度為7.69%；藍細菌門(Cyanobacteria)，相對物種豐度為5.20%；厚壁菌門(Firmicutes)，相對物種豐度為2.50%。C樣品中的擬桿菌門的相對物種豐度為19.22%，厚壁菌門的相對物種豐度7.81%明顯高于其他樣品。

對比綱水平(Class)的物種豐度(圖6)，分析得到所占比例最多的3個綱依次是α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)，其中α-變形菌綱平均相對物種豐度為42.53%，黃桿菌綱平均相對物種豐度為10.92%，芽孢桿菌綱(Bacilli)平均相對物種豐度為5.31%。對比各站位綱水平物種豐度(圖7)，C樣品α-變形菌綱的相對物種豐度為30.20%，低于平均豐度12.33%；黃桿菌綱的相對物種豐度為18.92%，高于平均豐度8.00%；芽孢桿菌綱[11]相對物種豐度為7.54%，高于其他站位平均相對物種豐度2.23%。

注：1.變形菌門；2.擬桿菌門；3.放線菌門；4.藍細菌門；5.厚壁菌門；6.海微菌門進化菌；7.其他。

注：1.α-變形桿菌綱；2.γ-變形桿菌綱；3.黃桿菌綱；4.微酸菌綱；5.β-變形桿菌綱；6.葉綠體；7.桿菌綱；8.藍細菌綱；9.δ-變形桿菌綱；10.放線菌綱；11.未確認；12其他。圖7同此。

對目水平(Order)物種豐度進行分析得出，平均相對物種豐度最高的5個目分別是紅細菌目(Rhodobacterales)24.53%、黃桿菌目(Flavobacteriales)[12]10.92%、海洋螺菌目(Oceanospirillales)9.84%、SAR11_clade 9.58%、酸微菌目(Acidimicrobiales)[13]6.38%。A、B樣品中酸微菌目分別為8.30%和7.71%，均高于平均相對物種豐度；B樣品交替單胞菌目(Alteromonadales)相對物種豐度達到14.19%；C樣品中黃桿菌目物種豐度18.92%高于平均相對物種豐度8.00%，SAR11_clade相對物種豐度4.42%低于平均相對物種豐度；D樣品的SAR11_clade和嗜甲基菌目(Methylophilales)相對物種豐度分別為16.52%和5.13%，與平均相對物種豐度相比均有大幅上漲。微酸菌存在于酸性廢礦水中，對環境具體有什么影響還有待進一步研究；黃桿菌對有機物有明顯的分解作用，C站位出現黃桿菌，是微生物對環境適應性自然生物修復的表現。

對科水平(Family)物種豐度進行分析得出，樣品中平均相對物種豐度最多的科分別是紅螺菌科(Rhodobacteraceae)24.53%、Surface_1 8.96%、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)8.51%和OM1_clade 4.71%。B樣品中交替單胞菌科(Alteromonadaceae)相對物種豐度為8.93%，假單胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)相對物種豐度為3.37%，遠大于其他樣品。C樣品中黃桿菌科相對物種豐度為15.88%，比平均相對物種豐度高7.37%，Oceanospirllaceae和Planococcaceae相對物種豐度分別為6.75%和6.10%，也都遠高于其他樣品，但是Surface_1相對物種豐度很低，只有4.10%。D樣本中Surface_1相對物種豐度突破15.50%，嗜甲基菌科(Methylophilales)的物種豐度達到5.13%，紅螺菌科的物種豐度為3.99%，均高于其他樣品豐度。E海水樣品中Oceanospirllaceae的物種豐度有5.41%，弧菌科(Vibrionaceae)相對物種豐度6.62%，Cryomorphaceae相對物種豐度3.06%高于其他樣品。

對屬水平(Genus)物種豐度進行分析得出，55%以上的屬還沒有確定分類，每個樣品中物種豐度最高屬不一樣，且差異較大。各樣本中的第一優勢屬及其相對物種豐度分別為：A樣本中Tateyamaria相對物種豐度為5.83%，B樣本中假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)物種豐度為8.32%，C樣本中動性球菌屬(Planococcus)相對物種豐度為6.02%，D樣本中OM43菌屬相對物種豐度為5.13%，E樣本中弧菌屬(Vibrio)物種豐度為6.49%。

2.5 樣品組間差異物種分析

對兩兩組合計算，R-value均介于(-1，1)之間，R-value大于0說明組間差異顯著，R-value小于0代表組內差異大于組間差異。分析數據結果R-value均在(0，1)之間，說明組間差異顯著，組內差異較小，5個海水樣品中對組間差異影響較大的差異物種有顯著差異，并且差異物種對組間差異影響的程度也有一定的差別。

2.6 羅源灣內環境因子結果分析

對海水樣進行環境因子的檢測，得出數據見表4，平均pH值為7.98、平均鹽度為29.97、水體中溶解氧的平均值為6.76 mg/L、平均化學耗氧量為0.4%、亞硝酸鹽-氮平均值為0.03 mg/L、硝酸鹽-氮為0.41 mg/L及氨-氮為0.07 mg/L，B站位糞大腸菌群計數(FCB)最高。

表4 羅源灣海水樣品環境因子測定結果

對照5個優勢門的菌類進行環境因子相關性分析。圖8顯示變形菌門與pH呈正相關，與營養鹽呈微弱正相關；擬桿菌門與溶解氧和鹽度呈正相關；放線菌門與營養鹽呈正相關，并隨著硝氮和亞硝氮的升高而菌群豐度增加；藍細菌門與pH和化學耗氧量呈正相關；厚壁菌門與pH、鹽度、石油類均呈正相關。大多數細菌群落都同時受多種環境因子的影響，影響最明顯的環境因子是pH和營養鹽，例如，C樣品中pH和鹽度均高于平均值，擬桿菌門和厚壁菌門豐度均高于其他樣品；B樣品中亞硝酸鹽-氮、硝酸鹽-氮及氨-氮含量最高，物種遺傳多樣性豐度分析結果OTU值最高，由此可見pH和無機氮含量是影響羅源灣海灣細菌群落分布及多樣性的主要環境因子。

注：1.藍細菌門；2.變形菌門；3.放線菌門；4.擬桿菌門；5.厚壁菌門；6.酸堿度；7.化學耗氧量；8.硝酸鹽氮；9.糞大腸菌群；10.氨氮；11.活性硅酸鹽；12.亞硝酸鹽氮；13.活性磷酸鹽；14.溶解氧；15.懸浮物；16.石油類；17.鹽度。

3 結論

2018年11月采集的羅源灣海灣5個站位的樣品，通過宏基因組測定分析菌種結構多樣性，菌群數目從大到小排列為B>A>D>E>C，即污水排放口>生活密集區>灣內遠離污染地區>出海口>火電站排污口，A樣品特有OTU數目91個，B樣品特有OTU數64個，C樣品特有OTU 數目有51個，D樣品特有OTU數27個，E樣品特有OTU數32個。結果表明A站位是生活密集區、B站位是污水排放口，水文環境富營養化明顯，細菌種群數目相近且最多，細菌多樣性最豐富。2016年羅源灣內已完成養殖全面清退，養殖業對水體的污染可以排除，但排污口及生活密集區內的人類活動形成的污染不容忽視；C站位火電廠污水排放雖然造成的生物復雜程度變化不明顯，但黃桿菌和芽孢桿菌等豐度均高于其他站位，研究表明黃桿菌和芽孢桿菌對油類有分解作用[12，14]，火電廠污水中含有的油類對其他微生物的生長呈現負相關關系，也解釋了C站位的OTU數目低于其他站位的原因；D、E兩點作為遠離污染的區域，污染物對細菌多樣性影響不大，群落較單純。由此可見主要排污口和生活污水的排放是造成羅源灣海水富營養化的主要因素，火電站的排污口排放的油類使細菌多樣性受到影響，菌群結構缺失。

在門(Phylum)水平對比得到5個優勢門及其相對物種豐度分別為：變形菌門相對物種豐度為72.00%，擬桿菌門相對物種豐度為11.28%，放線菌門相對物種豐度為7.69%，藍細菌門相對物種豐度為5.20%，厚壁菌門相對物種豐度為2.50%。對照5個優勢門的菌類進行環境因子相關性分析，顯示變形菌門與pH呈正相關，與營養鹽呈微弱正相關；擬桿菌門與溶解氧和鹽度呈正相關；放線菌門與營養鹽呈正相關，并隨著硝酸鹽-氮和亞硝酸鹽-氮的升高而菌群豐度增加；藍細菌門與pH和化學耗氧量呈正相關，厚壁菌門與pH和鹽度、石油類呈正相關。大多數細菌群落都同時受多種環境因子的影響，例如C樣品中pH及鹽度高于平均值，擬桿菌門和厚壁菌門豐度均高于其他樣品；B樣品中亞硝酸鹽-氮、硝酸鹽-氮及氨-氮含量最高，OTU值最高，由此可見pH和無機氮含量是影響羅源灣海灣細菌群落分布及多樣性的主要環境因子。

綜上所述，本論文總結如下：1)主要排污口和生活區的污水排放是造成羅源灣海水富營養化的主要因素，火電站的排污口排放的油類使細菌多樣性受到影響，菌群結構缺失；2)pH和無機氮含量是影響羅源灣海灣微生物群落分布及多樣性的主要環境因子。

4 展望

本文結合分子生物學和微生物學等學科對羅源灣的生態結構、菌群特點進行分析，研究羅源灣環境因子對細菌多樣性的影響，為改善海洋生態系統平衡、穩定海洋生物能量轉化奠定了基礎?；诒疚牡难芯拷Y果，對以后的研究方向提出幾點展望：1)本文只研究了冬季的羅源灣內細菌多樣性，并只測定了當月的環境因子，對季節、洋流、藻類等造成的影響沒有規劃，之后的研究要結合時間跨度和其他特定條件進行細菌多樣性的比較；2)繼續研究沉積物中的細菌多樣性，形成對比分析，更全面地了解該海灣的細菌菌群及生態系統結構。