ALI時MicroRNA-21通過PTEN調控PI3KAKT途徑影響MSC存活的研究

邵建平 蔡施霞 孫運波 方巍 劉冰 李連弟

感染、創傷、休克、輸血等均可造成肺毛細血管內皮細胞彌漫性損傷、肺泡上皮細胞彌漫性損傷，進而出現急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[1]。急性肺損傷是以機械通氣為主的器官支持治療，肺損傷的修復主要依靠殘留肺組織自身的增殖和分化修復能力受到限制，且容易導致損傷后肺泡結構的毀損和肺纖維化；因此，外源性給予間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）為ALI的損傷修復提供了新的途徑。外源性予以間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）源于中胚層，具有高度自我更新能力和多向分化潛能；臨床前期試驗證實予以外源性間充質干細胞可以歸巢至損傷肺組織，分化為肺泡上皮細胞、肺血管內皮細胞促進損傷肺組織的修復，提高急性肺損傷的生存率。但MSC移植后存活率極低，移植入肺自身細胞的數量少，MSC能表達多種microRNAs（miRNAs）在自身增殖及凋亡中發揮重要作用；因此，探討ALI時調節MSC凋亡、增殖相關的miRNAs及其作用機制有助于為增加移植后的細胞存活率找到新的治療靶點[2]。本研究觀察急性肺損傷時miRNA-21通過磷酸酯酶一張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homology，PTEN）調控PI13K/AKT信號通路途徑影響間充質干細胞存活的研究，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 試驗動物

2020年3 月—2020年9月中國人民解放軍第三軍醫大學大坪醫院動物中心提供的清潔級SD大鼠120只，體質量為50 g，雄性，許可證號SCXK（渝）2012-0005。根據隨機對照法分組，分為空白對照組（n=40）、ALI組（n=40）、MSC處理組（n=40），三組的平均體質量、性別等資料大體一致（P＞0.05），差異不具有統計學意義。

1.2 儀器與試劑

細胞培養室、蘇州凈化設備有限公司生產的超凈工作臺、美國Thermo提供的二氧化碳恒溫培養箱、德國Eppendorf Centrifuge高速冷凍離心機、實時定量熒光PCR儀、賽默飛Applied Biosystems基因擴增儀、Invitrogen微型水平電泳儀、美國BIO-RAD伯樂高壓電泳儀、日本OLYMPUS生產的TMS-1015型光學倒置顯微鏡、德國OLYMPUS生產的倒置熒光顯微鏡，廣州迪奧生物科技有限公司Deaou-380C恒溫熒光檢測儀、Bio-Rad蛋白電泳和轉印系統、德國Forma Scientic -80℃低溫冰箱、電子天平、德國 Forma Scientic A200S型電子分析天平、Spectre Max 250 酶標儀等設備。武漢博士德生物公司生產的兔抗大鼠PTEN多克隆抗體、兔抗大鼠P-AKT多克隆抗體、兔抗大鼠T-AKT多克隆抗體，廣州銳博生物科技公司生產的Mir-21模擬物及陰性對照。

1.3 方法

（1）H2O2/SD刺激間充質干細胞，明確miR-21對MSC凋亡和增殖的調節及其機制：分離培養SD大鼠脊髓間充質干細胞（MSC），流式細胞學檢驗細胞表面標志，誘導分化能力檢測，1 h、2 h、6 h或24 h后，Annexin V-FTTC+PI FCM分析細胞凋亡；MTS法分析細胞增殖；臺盼藍染色法LDH測定細胞活力；RT-PCR法檢測PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因表達；westem blot檢測PTEN、PI13j、Akt Bcl2蛋白表達；（2）高表達miR-21的MSC在ALI小鼠體內凋亡和肺保護作用的研究：分離培養SD大鼠脊髓MSC，流式細胞學檢驗細胞表面標志，誘導分化能力檢測，分為野生型MSC、miR-21MSC、沉默PTEN的miR-21-MSC、LY294002處理的miR-21-MSC；SD雄性大鼠，分為三組，空白對照組：氣道注入NS；ALI組氣道注入LPS；MSC處理組氣道注入LPS；MSC處理組30 min后尾靜脈注射MSC；ALI組30 min后尾靜脈注入NS；1 h、6 h、24 h或3 d后處死；熒光顯微鏡觀察MSC存留率、免疫熒光共定位、Tunel法分析MSC細胞凋亡情況；活體發光熒光成像系統分析MSC移植后凋亡情況；損傷肺組織評分分析肺組織病理學；肺濕/干重比Evans藍檢測肺血管屏障通透性分析肺水滲出情況。

1.4 評估標準

陽性信號評估標準[3]：棕黃色顆粒狀為陽性表達信號，Bcl-2、AKT mRNA、PI3K陽性信號位于細胞質，AKT位于細胞膜及細胞質，PI3K mRNA陽性信號位于細胞核及細胞質。Tunel法表達評估標準[4]：陽性信號：黃綠色熒光，藍色熒光為無凋亡小體的細胞核，凋亡指數：每張切片在高倍鏡下選擇不同視野5個，觀察每個視野的100個細胞，計算凋亡細胞所占的百分比，并計算平均值，平均值為凋亡細胞計數與細胞總數的百分比。

1.5 統計學方法

全部數據傳輸至SPSS 21.0軟件處理分析，計量資料為t檢驗，采用（±s）表示，計數資料為χ2檢驗，采用（n，%）表示，P＜0.05則差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 空白對照組、ALI組、MSC處理組的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達水平分析

ALI組、MSC處理組的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達高于空白對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；MSC處理組的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因表達低于ALI組，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1～3。

表1 空白對照組、ALI組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達分析 （±s）

表1 空白對照組、ALI組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達分析 （±s）

指標 空白對照組（n=40） ALI組（n=40） t值 P值PI3K 蛋白 0.003±0.002 0.198±0.027 45.552 5 ＜ 0.001 PI3KmRNA 0.009±0.003 0.186±0.036 30.988 3 ＜ 0.001 PTEN 蛋白 0.006±0.003 0.267±0.038 43.305 0 ＜ 0.001 PTENmRNA 0.010±0.004 0.365±0.034 65.583 5 ＜ 0.001 AKt蛋白 0.011±0.003 0.532±0.094 35.036 3 ＜ 0.001 AKtmRNA 0.013±0.002 0.646±0.026 153.525 1 ＜ 0.001 Bcl2 蛋白 0.012±0.004 0.798±0.026 188.972 9 ＜ 0.001 Bcl2mRNA 0.015±0.001 0.638±0.087 45.286 6 ＜ 0.001

2.2 不同MSC細胞表面標記誘導分化的MSC存留率、MSC移植后細胞存活率分析

LY294002處理的miR-21-MSC標記細胞、沉默PTEN的miR-21-MSC標記細胞的MSC存留率、MSC移植后細胞存活率高于miR-21-MSC、野生型MSC細胞，肺濕/干重比低于miR-21-MSC、野生型MSC細胞，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 不同MSC細胞標記誘導分化的MSC存留率、MSC移植后細胞存活率分析（±s）

表4 不同MSC細胞標記誘導分化的MSC存留率、MSC移植后細胞存活率分析（±s）

注：*P＜0.05，與其他組相比；#P＜0.05，與miR-21-MSC細胞、野生型MSC細胞相比

細胞表面標記 MSC存留率（%） MSC移植后細胞存活率（%） 肺濕/干重比LY294002 處理的 miR-21-MSC 79.09±10.69* 76.36±9.78* 4.34±0.16*沉默的 PTENmiR-21-MSC 64.60±7.85# 60.89±6.25# 4.52±0.21#MiR-21-MSC 細胞 30.01±3.23 28.64±0.98 6.35±0.36野生型 MSC 細胞 20.01±2.36 18.83±1.53 8.40±0.43

3 討論

本研究觀察急性肺損傷（ALI）時miRNA-21通過磷酸酯酶一張力蛋白同源物（PTEN）調控PI13K/AKT信號通路途徑影響間充質干細胞（MSC）存活情況，結果顯示：ALI組、MSC處理組的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達高于空白對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；MSC處理組的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因表達低于ALI組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；LY294002處理的miR-21-MSC標記細胞、沉默PTEN的miR-21-MSC標記細胞的MSC存留率、MSC移植后細胞存活率高于miR-21-MSC、野生型MSC細胞，肺濕/干重比低于miR-21-MSC、野生型MSC細胞，差異具有統計學意義（P＜0.05），與張莉珊等[5]的研究結果大體一致，間充質干細胞可通過旁分泌調節內皮和上皮的通透性，調節免疫減輕炎癥反應，以及抑制細菌的生長[6-7]；體外模擬急性肺損傷時MSC的生存環境，觀察MSC的凋亡和增殖，miRNA-21及其靶基因PTEN和PI3K/Akt信號通路相關因子的表達，明確miRNA-21對ALI時MSC凋亡和增殖調節作用及其具體分子機制[8]；通過移植入高表達miR-21的MSC，在體實驗證實ALI時miR-21能通過靶基因PTEN和PI3K/Akt信號通路促進MSC增殖、抑制凋亡，提高MSC移植后存活效率，并能增強在體MSC修復肺損傷和保護肺功能的作用[9-10]。

本研究的創新點在于關注miR-21對ALI時MSC凋亡和增殖的作用及調節機制。首次提出miR-21通過其靶基因PTEN及PI3K/Akt信號途徑調控ALI時MSC的凋亡和增殖，增加ALI時MSC移植后存活率的假設[11-12]；通過轉染調節miR-21的表達，測定其靶基因PTEN及PI3K/Akt信號通路關鍵分子的變化，并觀察MSC的凋亡和增殖，闡明miR-21調控MSC存活的具體機制，為提高MSC治療ALI的療效提供了理論依據。研究發現，大鼠MSC中PTEN可能是miR-21潛在的作用靶基因；氧化應激條件下，MSC的miR-21的表達與PTEN的蛋白表達呈負性相關；MSC可減輕LPS誘導的ALI小鼠的病理改變和肺水的滲出。

表2 空白對照組、MSC處理組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達分析 （±s）

表2 空白對照組、MSC處理組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達分析 （±s）

指標 空白對照組（n=40） MSC處理組（n=40） t值 P值PI3K 蛋白 0.003±0.002 0.096±0.014 41.590 9 ＜ 0.001 PI3KmRNA 0.009±0.003 0.094±0.018 29.459 6 ＜ 0.001 PTEN 蛋白 0.006±0.003 0.135±0.018 44.709 3 ＜ 0.001 PTENmRNA 0.010±0.004 0.184±0.016 66.726 0 ＜ 0.001 AKt蛋白 0.011±0.003 0.226±0.017 78.769 9 ＜ 0.001 AKtmRNA 0.013±0.002 0.352±0.014 151.605 4 ＜ 0.001 Bcl2 蛋白 0.012±0.004 0.352±0.013 158.096 8 ＜ 0.001 Bcl2mRNA 0.015±0.001 0.319±0.015 127.893 8 ＜ 0.001

表3 ALI組、MSC處理組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達分析 （±s）

表3 ALI組、MSC處理組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達分析 （±s）

指標 ALI組（n=40） MSC處理組（n=40） t值 P值PI3K 蛋白 0.198±0.027 0.096±0.014 21.210 9 ＜ 0.001 PI3KmRNA 0.186±0.036 0.094±0.018 14.456 4 ＜ 0.001 PTEN 蛋白 0.267±0.038 0.135±0.018 19.854 7 ＜ 0.001 PTENmRNA 0.365±0.034 0.184±0.016 30.464 3 ＜ 0.001 AKt蛋白 0.532±0.094 0.226±0.017 20.2598 ＜ 0.001 AKtmRNA 0.646±0.026 0.352±0.014 62.967 9 ＜ 0.001 Bcl2 蛋白 0.798±0.026 0.352±0.013 97.036 8 ＜ 0.001 Bcl2mRNA 0.638±0.087 0.319±0.015 22.852 9 ＜ 0.001

綜上所述，探討ALI時調節MSC凋亡、增殖相關的miRNAs及其作用機制有助于為增加移植后的細胞存活率找到新的治療靶點。