基于16S rDNA測序技術分析異煙肼致大鼠肝損傷中腸道菌群變化特征

吳冬雪，李玉紅，裴盛斐，王 林，楊璐銘，張 咪，王 雪，朱晗瑀，郝金奇，馮福民,5

異煙肼(isoniazid，INH)是世界衛生組織和國際防癆與肺病聯合會推薦的一線抗結核藥物之一，但長期使用可能會引起多種不良反應，其中最嚴重的副作用是抗結核藥物性肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ADLI)，其是導致結核病復發和產生耐藥性的重要原因之一。

腸道菌群被譽為人類“第二基因組”，與人體健康息息相關。正常情況下，腸道菌群處于相對穩定狀態，能夠維持腸道屏障的完整性，抵御病原微生物的入侵，而大量服用抗生素類藥物則會導致腸道菌群紊亂。已有研究表明腸道菌群與對乙酰氨基酚、他克林等藥物導致的肝損傷之間存在聯系，但是關于腸道菌群與ADLI之間的關系研究尚屬空白。該研究應用16S rDNA測序技術分析INH致ADLI大鼠肝損傷模型中腸道菌群的變化情況。

1 材料與方法

1.1 研究材料

SPF級6～8周齡雄性SD大鼠24只，體質量180～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于華北理工大學實驗動物中心清潔動物房，大鼠自由進食與飲水，交替照明各12 h，溫度24 ℃左右，相對濕度60%～80%。INH購自沈陽紅旗制藥有限公司(批號：140402)。本研究已獲華北理工大學動物倫理委員會審查批準(批文號：LX2018137)。

1.2 動物分組

24只SD雄性大鼠適應性喂養1周后，隨機分為對照組(D0組，

n

=8)、INH灌胃10 d組(H10組，

n

=8)、INH灌胃28 d組(H28組，

n

=8)。D0組于實驗開始0 d處死，H10組和H28組給予50 mg/(kg·d)灌胃，分別于連續灌胃10 d和28 d后處死各組所有大鼠。

1.3 標本采集

大鼠處死后取部分肝組織，經10%福爾馬林固定、脫水、包埋獲得4 μm厚度切片，HE染色后，置于光學顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

末次給藥24 h后，收集大鼠新鮮糞便顆粒于5 ml無菌凍存管中，置于-80 ℃保存。

1.4 16S rDNA測序

每組使用隨機數字表法隨機選取4只大鼠的糞便標本送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16S rDNA測序。

1.5 腸道菌群測序結果分析

α多樣性分析采用Sobs指數和Shannon指數；β多樣性分析采用主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)，使用相似性分析(analysis of similarities，Anosim)評估組間差異；分別從門和屬水平比較各組大鼠腸道菌群組成。

1.6 生物信息學分析

Heatmap圖以顏色梯度來呈現物種組成及豐度信息。根據樣本間豐度的相似性進行聚類，可使高、低豐度的物種分塊聚集，通過顏色變化反映各組在屬水平上群落組成的相似性和差異性。

1.7 統計學處理

使用STAMP和R軟件進行組間差異分析。STAMP軟件中的ANOVA檢驗和R stats包中的Kruskal-Wallis秩和檢驗用于多組間差異分析，Wilcoxon秩和檢驗用于兩組間差異分析。非正態分布的數據采用

M

(

P

,

P

)表示。

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗大鼠肝組織病理學結果

D0組肝細胞以小葉中央靜脈為中心呈放射狀整齊排列，無明顯水腫或炎癥改變；H10組肝組織中部分區域出現肝細胞胞漿疏松化和氣球樣變，伴有點狀壞死；H28組可見肝小葉結構和肝索完全破壞，出現明顯橋接樣壞死，大面積肝細胞溶解性壞死(圖1)。

圖1 三組大鼠肝組織病理學光鏡圖 HE×200A：D0組；B：H10組；C：H28組

2.2 實驗大鼠菌群測序稀釋曲線分析

測序樣本的微生物群落Sobs指數和Shannon指數稀釋曲線趨向平坦，說明測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種(圖2)。

圖2 腸道菌群測序的稀釋曲線A：Sobs指數；B：Shannon指數

2.3 實驗大鼠腸道菌群α多樣性分析

α多樣性反映微生物群落的豐富度和多樣性。結果顯示，各組Sobs和Shannon指數均差異無統計學意義(

P

>0.05)(圖3)。說明在INH致大鼠肝損傷過程中腸道菌群的豐富度和多樣性未發生改變。

圖3 三組大鼠腸道菌群的α多樣性A：Sobs指數；B：Shannon指數

2.4 實驗大鼠腸道菌群β多樣性分析

β多樣性分析反映樣本群落組成的相似性。PCoA圖和Adonis分析顯示，各組組內樣本呈現聚集傾向，而組間樣本坐標均能分開，表明三組大鼠組內菌群結構相似，組間菌群結構存在差異(

R

=0.432,

P

=0.001)(圖4)。圖4中樣本距離越遠，菌群結構差異越大；

R

表示分組對樣本差異的解釋度，

R

值越大，表示分組對差異的解釋度越高。說明給予大鼠INH藥物灌胃10 d和28 d分別不同程度地改變了大鼠腸道菌群結構。

圖4 三組大鼠腸道菌群的PCoA圖

2.5 實驗大鼠腸道菌群物種組成分析

在門水平上，三組大鼠糞便菌群均主要由6個門構成。Firmicutes和Bacteroidetes占總細菌的85%以上，是絕對優勢菌。Kruskal-Wallis檢驗結果顯示，Actinobacteria、Verrucomicrobia、Patescibacteria和Tenericutes的豐度變化在三組之間有差異。與D0組比較，給予INH可導致Tenericutes豐度增加，Verrucomicrobia豐度減少，Actinobacteria和Patescibacteria豐度先增加后減少(均

P

<0.05)。進一步進行兩兩比較發現，與D0組比較，H10組各個門的豐度無明顯改變，而H28組Actinobacteria、Verrucomicrobia和Patescibacteria的豐度減少，Tenericutes的豐度增加；與H10組比較，H28組Actinobacteria和Patescibacteria的豐度減少(均

P

<0.05)(圖5)。

圖5 三組大鼠腸道菌群在門水平的組成及差異分析A：三組大鼠腸道菌群在門水平的物種組成；B：三組大鼠腸道菌群的菌門差異比較；C：D0組和H28組的菌門差異比較；D：H10組和H28組的菌門差異比較

在屬水平上，三組大鼠糞便菌群均主要由22個屬構成。Kruskal-Wallis檢驗結果顯示，共有12個屬的相對豐度變化在三組間有統計學差異。與D0組比較，給予INH藥物可導致Ruminococcaceae_UCG-005、Dubosiella、norank_f__norank_o__Mollicutes_RF39、unclassified_f__Ruminococcaceae、Roseburia、Blautia豐度增加，Lactobacillus、Romboutsia、Akkermansia豐度減少，Bifidobacterium、Candidatus_Saccharimonas豐度先增加后減少，Ruminococcus_1豐度先減少后增加(均

P

<0.05)。進一步進行兩兩比較發現，與D0組比較，H10組Roseburia和Dubosiella的豐度分別減少和增加，H28組Lactobacillus、Romboutsia和Akkermansia減少，Ruminococcaceae_UCG-005、norank_f__norank_o__Mollicutes_RF39、unclassified_f__Ruminococcaceae、Roseburia和Blautia增加；與H10組比較，H28組Lactobacillus、Bifidobacterium和Candidatus_Saccharimonas豐度減少，Ruminococcus_1和Blautia豐度增加(圖6)。基于屬水平的Heatmap分析與上述結果一致(圖7)。

圖6 三組大鼠腸道菌群在屬水平的組成及差異分析A：三組大鼠腸道菌群在屬水平的物種組成；B：三組大鼠腸道菌群的菌屬差異比較；C：D0組和H10組的菌屬差異比較；D：H10組和H28組的菌屬差異比較；E：D0組和H28組的菌屬差異比較

圖7 三組大鼠腸道菌群在屬水平的Heatmap分析

3 討論

研究采用16S rDNA測序技術初步探索了INH致大鼠ADLI時腸道菌群的變化特征，發現大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性未發生改變，而腸道菌群結構和組成卻發生變化。

物種組成分析發現，INH灌胃10 d和28 d后，Verrucomicrobia豐度減少，而Tenericutes豐度增加，但各組大鼠腸道中的絕對優勢菌Firmicutes和Bacteroidetes未發生明顯改變。說明在INH致大鼠ADLI時，不影響腸道優勢菌的種類，但對其組成比例有一定影響。在屬水平上，大鼠腸道中的一些有益共生菌屬含量減少，如Lactobacillus、Romboutsia和Akkermansia。Lactobacillus作為人體腸道正常菌群之一，已被發現在不同肝病中均有潛在的預防和治療價值，如補充鼠李糖乳桿菌可保護肝臟免受對乙酰氨基酚過量和急性乙醇中毒導致的氧化性損傷。Romboutsia歸屬于Firmicutes，是常見的腸道細菌，參與機體能量代謝，與肝臟損傷密切相關。Akkermansia是一種很有前景的益生菌，可以治療性改善酒精性肝病引起的肝損傷，也可預防性減少乙醇誘導肝損傷和脂肪變性。本研究中，INH致大鼠ADLI時，豐度增加的菌屬大部分歸屬于厚壁菌門的Ruminococcaceae和Lachnospiraceae，具有次級膽汁酸生成能力。Ma et al發現次級膽汁酸可通過抑制CXC趨化因子配體16蛋白抑制自然殺傷T細胞的激活來促進肝腫瘤的發生。也就是說，腸道菌群可以通過調節次級膽汁酸的生成調控肝臟中的免疫細胞影響疾病進程。

本研究利用動物模型首次證明了腸道菌群與ADLI之間存在緊密聯系，分析了INH致大鼠ADLI時腸道菌群的變化特征。但由于腸道微生物的組成結構復雜，腸道菌群與ADLI之間的因果關系及具體作用機制還需要進一步研究。