線粒體DNA對Caco-2細胞通透性的影響及機制

李會會，王迪迪，楊 彬，袁靜靜，陳利雪，劉秋圓，丁 浩，梅 俏，劉曉昌

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種非特異性腸道炎癥性疾病，以損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)為代表的炎癥介質具有增加IBD中腸黏膜通透性的作用。研究表明，IBD中DAMPs(包括HMGB1、IL-33和mtDNA等)水平增加，通過不同機制導致IBD的黏膜炎癥。mtDNA作為強致炎性的DAMPs，可與Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)結合，激活炎癥通路，參與肺部炎癥和關節炎等疾病的炎癥過程。外源性mtDNA可以增加大鼠肺灌注通透性，阻斷TLR9可以抑制這一過程，表明mtDNA在肺內皮細胞屏障破壞中起關鍵作用。但mtDNA是否通過調控TLR9信號通路影響腸上皮細胞的通透性尚不明確，因此該研究在建立Caco-2細胞單層模型的基礎上，探討mtDNA是否通過調控TLR9信號通路影響IBD的腸黏膜通透性及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6J小鼠40只(雄性，6～8周)購自安徽省實驗動物中心；肝素鈉、膠原酶Ⅳ購自德國BioFroxx公司；Mitochondrial DNA Isolation Kit(ab65321)試劑盒購自英國Abcam公司；Caco-2人結直腸腺癌細胞購自中國科學院干細胞庫；BI血清購自以色列生物科技公司；PBS、高糖DMEM培養基購自美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素混合液、非必須氨基酸、0.25%胰蛋白酶購自北京索萊寶生物科技有限公司；MILLICEL@-ERS購自美國MILLIPORE公司；Transwell inserts(型號3413)購自美國康寧公司；FITC-dextran(分子量3-5 ku)購自美國Sigma-adrich公司；多功能酶標儀購自美國PE公司；腫瘤壞死因子-ɑ(tumour necrosis factor-ɑ,TNF-ɑ)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司、ODN TTAGGG(A151)購自美國Invivogen公司；TRIzol購自美國ambion公司；三氯甲烷購自上海西隴科學股份有限公司；DEPC水(RNase-free水)購自北京Biosharp公司；RT-PCR反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；Actin引物、TLR9引物由上海生工生物工程股份有限公司設計與合成；qRT-PCR儀購自美國Agilent Mx3000P公司。

1.2 方法

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mtDNA提取 采用膠原酶Ⅳ消化法制備小鼠肝細胞，按Mitochondrial DNA Isolation Kit(ab65321)試劑盒方法提取mtDNA。用超微量分光光度計檢測mtDNA的濃度以及純度，A260/A280的值在1.8～2.0之間表明mtDNA純度高，無蛋白質污染。-20°保存備用。

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建立Caco-2細胞單層模型 Caco-2細胞培養于37 ℃、5% CO的細胞培養箱中，使用10% BI血清、1%非必須氨基酸和1%青霉素-鏈霉素溶液進行培養，根據細胞生長狀況2～3 d更換1次培養基，顯微鏡下觀察細胞匯合程度達到80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，重懸細胞并計數，以5×10個/孔的密度接種于24孔Transwell inserts中，第一周每2 d更換1次培養基，之后每天更換1次培養基，直至21 d。根據說明書，采用 MILLICEL@-ERS (MILLIPORE)測量TEER，待TEER為400-550(Ω×cm)時表明Caco-2細胞單層模型建立成功。

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Caco-2細胞通透性檢測 通過測量TEER和FITC-dextran跨膜轉運量來評估Caco-2細胞通透性。

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實驗分組 在Transwell inserts頂側加入不同濃度的mtDNA(0、1、5、10 μg/ml)和FITC-dextran處理Caco-2細胞單層，分別在0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h測量并記錄各孔TEER，同時于底室取樣保存于-80 ℃冰箱備用。樣品在激發波長為480 nm，發射波長為520 nm條件下，用多功能酶標儀檢測各孔中FITC-dextran的熒光值，根據標準曲線計算出各孔FITC-dextran濃度。根據TEER和FITC-dextran含量確定最佳mtDNA濃度，然后在Transwell inserts頂側分別加入FITC-dextran、mtDNA+FITC-dextran、ODN TTAGGG+FITC-dextran和mtDNA+ODN TTAGGG+FITC-dextran，檢測不同時間TEER和底室中FITC-dextran含量的改變。

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炎癥因子檢測 Caco-2細胞培養于37 ℃，5% CO的細胞培養箱中，以3×10個/孔密度接種于6孔板，用10 μg/ml 的mtDNA作為對照， ODN TTAGGG作為 TLR9信號通路拮抗劑，孵育1 h后，用ELISA試劑盒檢測上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的水平

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qRT-PCR檢測TLR9 mRNA表達 將Caco-2細胞接種于6孔板，待細胞匯合度達到80%時，用10 μg/ml 的mtDNA作為對照， ODN TTAGGG作為 TLR9信號通路拮抗劑，0.5 h后，用TRIzol 提取RNA，用Takara公司的逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，采用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒進行定量PCR反應，反應條件為95 ℃、2 min一個循環；95 ℃、5 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s共40個循環。內參為β-actin，用2方法計算TLR9 mRNA的相對表達量。β-actin引物序列：正向引物5′-GGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′，反向引物5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAACG-3′；TLR9引物序列：正向引物5′-GCATCTCGCAGGCAGTCAATGG-3′，反向引物5′-CCGTGAATGAGTGCTCGTGGTAG-3′。

2 結果

2.1 mtDNA對Caco-2細胞單層通透性的影響

用不同濃度的mtDNA(0、1、5、10 μg/ml)處理Caco-2細胞單層，結果表明，隨著濃度的增加，mtDNA可以降低Caco-2細胞單層的TEER(圖1)，Transwell底室中的FITC-dextran含量增加(圖2)，在2 h內達到最大改變值。其中，以10 μg/ml的mtDNA對Caco-2細胞單層通透性改變最為顯著，提示mtDNA對細胞單層通透性的影響具有一定的量效和時效過程。

圖1 不同濃度mtDNA對Caco-2細胞單層TEER的影響

2.2 ODN TTAGGG對mtDNA引起的Caco-2細胞單層通透性增加的影響

用TLR9拮抗劑ODN TTAGGG與10 μg/ml mtDNA 一起處理Caco-2細胞單層，如圖3、4所示，與mtDNA組相比，ODN TTAGGG預處理抑制mtDNA引起的通透性增加，表明TLR9參與mtDNA引起Caco-2細胞單層通透性增加的作用過程。

圖2 不同濃度mtDNA對Caco-2細胞單層FITC-dextran滲透的影響

圖3 ODN TTAGGG對mtDNA預處理Caco-2細胞單層TEER的影響

2.3 mtDNA對Caco-2細胞的炎癥因子水平的影響

用10 μg/ml 的mtDNA作為對照，ODN TTAGGG作為TLR9信號通路拮抗劑處理Caco-2細胞，1 h后取Caco-2細胞培養上清液檢測TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的水平。如圖5～8所示，與對照組相比，差異有統計學意義(

F

=130.792，

P

<0.01；

F

=461.679，

P

<0.01；

F

=85.030，

P

<0.01；

F

=205.689，

P

<0.01)。ODN TTAGGG預處理可降低mtDNA引起的TNF-ɑ、IL-6、IL-1β和IL-18炎癥因子水平的增加，差異有統計學意義(

F

=137.030，

P

<0.01；

F

=380.618，

P

<0.01；

F

=131.536，

P

<0.01；

F

=1 247.583，

P

<0.01)。

圖4 ODN TTAGGG對mtDNA預處理Caco-2細胞單層FITC-dextran滲透的影響

圖5 mtDNA及ODN TTAGGG對Caco-2細胞TNF-ɑ的影響

圖6 mtDNA及ODN TTAGGG對Caco-2細胞IL-6的影響

2.4 mtDNA對Caco-2細胞TLR9 mRNA表達水平的影響

用10 μg/ml 的mtDNA作為對照，ODN TTAGGG作為TLR9信號通路拮抗劑處理Caco-2細胞，0.5 h后檢測Caco-2細胞的TLR9 mRNA水平。如圖9所示，與對照組相比，10 μg/ml 的mtDNA可以引起TLR9 mRNA表達水平增加， 差異有統計學意義(

F

=135.611，

P

<0.01)；ODN TTAGGG預處理可降低mtDNA引起的TLR9 mRNA表達水平增加，差異有統計學意義(

F

=224.742，

P

<0.01)。

圖7 mtDNA及ODN TTAGGG對Caco-2細胞IL-1β的影響

圖8 mtDNA及ODN TTAGGG對Caco-2細胞IL-18的影響

圖9 mtDNA及ODN TTAGGG對Caco-2細胞TLR9 mRNA表達水平的影響

3 討論

IBD是一種原因不明的慢性腸道炎癥性疾病，遺傳易感性、免疫反應失調、環境因素改變、腸道微生物組成異常等均與IBD的發生和發展有關，其中腸黏膜通透性增加是IBD發病的重要機制，研究腸黏膜通透性改變的調控因素可能在IBD的病理生理機制中具有重要影響。

腸黏膜的炎性損傷程度直接導致腸黏膜通透性增加，在參與腸黏膜炎癥過程的炎癥介質中，DAMPs的作用越來越受到重視。DAMPs本質上是由于細胞或組織損傷而表達或釋放的內源性應激蛋白，能刺激促炎細胞因子和趨化因子的釋放，具有直接促炎作用。研究表明DAMPs(包括HMGB1、IL-1α、IL-33等)通過激活與先天免疫直接相關的固有層細胞誘導腸道炎癥，可能在IBD中發揮作用，如細胞外HMGB1參與誘導腸上皮細胞自噬，增加黏附分子的表達，以及促炎細胞因子和趨化因子的分泌，IBD患者的固有層單核細胞中可以檢測到高水平的IL-1α，與健康對照組相比，活動期UC患者腸黏膜IL-33 mRNA的表達顯著增加。DAMP可能來源于不同的細胞內組分，包括細胞質、細胞核和線粒體，或者來源于細胞外基質，其中來源于線粒體的mtDNA是當前研究的熱點。

線粒體由產生能量的α細菌進化，形成以真核細胞為基礎的共生關系，與細菌有很多相似特征，其中最重要的是mtDNA與細菌DNA類似，含有大量非甲基化的CpG序列，在炎癥及免疫反應中有重要作用。正常情況下，mtDNA主要在細胞內參與線粒體蛋白質的合成，創傷和細胞凋亡等可以引起mtDNA釋放到細胞外環境，引起炎癥反應。在Collins et al發現將mtDNA注射到小鼠關節內時可以誘導TNF-α表達增高并引起關節炎，證明了mtDNA的促炎癥潛能。TLR9是一種高度保守的PRRs，在受到CpG-DNA刺激時，TLR9從內質網移位到內涵體和質膜識別配體并激活細胞炎癥通路。因此，mtDNA直接通過激活TLR9來激發免疫和炎癥反應，增加促炎細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β的表達。本研究表明mtDNA可增加TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平，可能與TLR9有關。mtDNA可通過cGAS-STING通路增加視網膜微血管內皮細胞中炎性細胞因子的表達，損傷視網膜微血管內皮細胞，破壞血視網膜屏障，可能引起視力障礙。富含CpG序列和TLR9配體的細菌DNA能夠改變內皮細胞通透性，增加中性粒細胞與內皮細胞的黏附，并與兩種細胞中黏附分子的上調有關。mtDNA可導致肺血管內皮細胞通透性改變，加重急性肺損傷。mtDNA在腸道炎癥方面的研究較少。Hu et al研究表明mtDNA通過激活STING通路誘導腸道炎癥反應。

本研究顯示，IBD患者血漿和血小板mtDNA水平增加，并且與疾病的活動性和嚴重程度有關。這些增加的mtDNA在IBD發病過程中的具有作用以及是否通過影響腸黏膜上皮細胞通透性參與IBD發生的機制尚不清楚。因此，本研究用不同濃度的mtDNA處理Caco-2細胞單層，顯示mtDNA能顯著增加Caco-2細胞單層的通透性，表明mtDNA可破壞腸道黏膜上皮細胞屏障，增加腸黏膜通透性。mtDNA增加Caco-2細胞的TLR9 受體mRNA水平，促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18等增加，表明mtDNA可直接引起腸上皮細胞合成大量炎癥介質，導致腸道炎癥損傷反應。用TLR9特異性抑制劑ODN TTAGGG預處理可顯著降低mtDNA引起的Caco-2細胞單層通透性的增加，降低TLR9受體mRNA水平和下游促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平，表明mtDNA增加腸黏膜通透性與TLR9信號通路有關。